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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » DNA回收产物浓度一般是多少？
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呀薯条

金虫 (小有名气)

[求助] DNA回收产物浓度一般是多少？ 已有5人参与

我需要做DNA与克隆载体的连接，用的是Takara的克隆载体，做了几次一直没有连接成功，通过微量测定仪，测定DNA在PCR后经电泳切胶回收的产物是12纳克每微升，最终没有连接成功，与DNA浓度太低有关吗？最终筛选用的是蓝白斑筛选吗？我是直接用抗生素培养基筛选，是不是对结果也会有影响。。求指导
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1楼 2014-04-10 10:43:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

上官尹悠

金虫 (职业作家)
我上次回收的浓度是108，是不是有点高

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努力，追求自己的追求！
10楼2014-04-14 11:23:56
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
呀薯条(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-10 12:43:06
不用蓝白斑筛选，没那个必要，连接转化做好了就OK

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5楼2014-04-10 12:23:20
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普通回帖

信仰爱

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我感觉影响不大，挺好连接的，昨天还做了下，成功了。
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2楼2014-04-10 11:16:55
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
呀薯条(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-04-10 12:42:53
“DNA在PCR后经电泳切胶回收的产物是12纳克每微升”
由于切胶回收的试剂中含有胍盐，所以使用OD260测定的浓度会不准确
看你是直接连接，没有进行酶切，你做的应该是TA连接吧
连接反应主要看的是载体和片段的比例，你可以尝试降低载体的浓度，多试验几个浓度梯度
如果是TA连接的话，还要注意你的PCR产物是不是有A接头，一般只有Taq系列的酶PCR产物有A接头，其他高保真的酶都是平末端，PCR之后需要用Taq等加A
蓝白斑筛选只是为了让结果可视化，你用抗生素筛选之后还要PCR检测等确认一下，二者没有本质的差别
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3楼2014-04-10 11:19:21
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
呀薯条(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-10 12:44:03
洗脱时用水比较好

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4楼2014-04-10 12:22:18
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geneyhh

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
呀薯条(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-10 12:44:16
12有点低，2O以上没问题，胶回收时离心时间25s即可，我习惯用OmEga的盒子，回收的效率较高！

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6楼2014-04-10 12:32:54
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xiaopangge

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-10 13:52:16
呀薯条: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-04-11 09:39:46
12ug有点低，一般在50以上，转化效率较高，蓝白斑筛选和青霉素筛选可以一起做的，转化失败的是蓝班，成功的是白斑。
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7楼2014-04-10 12:58:14
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呀薯条

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by woolley at 2014-04-10 11:19:21
“DNA在PCR后经电泳切胶回收的产物是12纳克每微升”
由于切胶回收的试剂中含有胍盐，所以使用OD260测定的浓度会不准确
看你是直接连接，没有进行酶切，你做的应该是TA连接吧
连接反应主要看的是载体和片段的比例 ...

我用的就是taq酶，那个DNA产物回收后，一般可以在零下20度保存多久啊
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8楼2014-04-11 09:42:59
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woolley

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 呀薯条 at 2014-04-11 09:42:59
我用的就是taq酶，那个DNA产物回收后，一般可以在零下20度保存多久啊...

不反复冻融的话，应该能放个半年以上吧
具体没有测试过
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9楼2014-04-14 10:36:55
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