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音四1990

铁虫 (小有名气)

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[求助] RACE产物太少，结果很差，求分析体系已有1人参与

RACE本来好好的突然出不来东西了小生好郁闷……求各路大神指点迷津啊！

从上学到现在，断断续续做着RACE，3‘RACE和5’RACE一起做。
用superswitch的试剂盒和里面的引物在RNA上加帽子结构和Poly（A）尾，对应的3、5端引物也是试剂盒里AP，基因特异性引物是根据核心序列设计好的。总共设计了三对引物好做nest。

之前3‘和5’都有了比较好的结果，3‘的1p产物回收后，分别用另外两个引物做了nest，得到的条带大小比较后，有三条不同大小的带都符合。
$\"RACE产物太少，结果很差，求分析体系\"$
上图是5’的2p，感觉特别好，但是反应液用TAKARA的试剂盒回收后就出问题了，电泳跑出来没东西，后续的PCR也做不出来。
$\"RACE产物太少，结果很差，求分析体系-1\"$
上图是3‘RACE的图，比较不同引物的nest结果，能看出哪些带是目的条带，同样的体系再重新跑，出来的图就完全不是这样了，什么都没有T T

为了切胶克隆再继续做，用同样的模板、引物、体系，却只有很淡很淡的条带甚至是没有，改变模板用量、引物用量、25和50ul都跑了，也用了TouchDown和之前的PCR条件，无论如何都出不来之前的条带。
5’的1p跑完后再跑nest，考虑到3‘的情况，模板做了2X、5X、10X的稀释，加0.5ul，引物用量做了0.1ul、0.2ul、0.5ul和1ul的调整，5X稀释的模板，引物0.5ul和1ul的，有产物，条带也比较亮，非特异性条带不多。
$\"RACE产物太少，结果很差，求分析体系-2\"$
但是RACE的那个引物真的好贵……就那么一丁点，每次加1ul的话5次就用完了……所以我还是用了0.1ul的引物，结果产物量非常少，模板还是5X稀释的，但跑出来几乎都在加样孔里，加样孔亮亮的下面什么都没有……感觉根本就没有进行PCR。

于是现在反复的做着RACE浪费着引物和酶，重复之前的条件，出来的图都是一个样：加样孔亮，有抹带，有时候拖带还很严重，预计的条带很淡，完全没办法进行切胶回收。
甚至那个图就跟瀑布一样……
$\"RACE产物太少，结果很差，求分析体系-3\"$
$\"RACE产物太少，结果很差，求分析体系-4\"$

$\"RACE产物太少，结果很差，求分析体系-6\"$
希望跑RACE成功的大神帮忙分析一下，问题可能出在哪里。
我的RNA因为反转过好几次，反复冻融过，所以我想会不会根本就是RNA质量差导致cDNA反转的一步就没做好。
酶和Buffer没有问题，引物会不会也降解呢？后期失败的PCR，跑出来的图基本都没有引物二聚体在下面。
在RACE过程中引物的量影响有多大呢？这种引物实在是贵……而且人家试剂盒里的引物我又没办法自己合成，所以只能省着用不能加多啊，会不会真的是引物太少导致的呢？
PCR程序用的是58度退火30s、72度延伸2m30s，之前能跑出东西，但是非特异条带有点多，用了TouchDown，68~55每循环数降0.5和每循环降2，每个温度3个循环两种程序，都没东西，

我都混乱了……
因为就我自己在做RACE别人都不做，所以只能向论坛里各位大神请教了……有经验的大神们快来拯救小生……T T