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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)

[求助] 测苹果CAT酶活性 已有1人参与

今天测CAT酶活性，使用0.1M PH7.5的磷酸缓冲液，提取液是用77mgDTT和5%pvpp混合定容至100ml.最后测定使用20mmol的过氧化氢溶液加上100微升酶提取液。吸光值一直不变。。。。。保持一个值为什么？？？？？是什么原因啊？？？！！！求大神解答

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1楼 2014-03-31 22:54:36
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

酶提取液就用PBS+pvp就好
酶失活的可能很多，在实验中尽量注意，比如提取液要预冷，研磨使用液氮或在冰上进行，离心要4度，混匀不能太剧烈，等等等
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8楼2014-04-03 09:29:14
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
lz是用测定过氧化氢的残余量来判定的吧，比色皿是用的石英的吗？过氧化氢过期了吗？
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2楼2014-04-01 14:55:00
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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-04-01 14:55:00
lz是用测定过氧化氢的残余量来判定的吧，比色皿是用的石英的吗？过氧化氢过期了吗？

过氧化氢没过期，比色mi是石英的，第一次做，为什么说我是测过氧化氢残余量呢？按理说吸光值应该一直下降。。。。我的真是不知道怎么回事

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3楼2014-04-02 10:54:20
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小小鱼泪了: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 很好啊，真的很感谢 2014-04-03 10:53:07
我仔细看了你的反应体系，lz应该再确定下反应体系中各成分的含量
1、DTT，会还原酶的二硫键，此处可以不加
2、过氧化氢浓度，生化实验书上的反应体系是3ml 15mM过氧化氢 + 0.1 ml酶液，你加20mmol过氧化氢太多太多了
3、提取的酶的浓度是否合适，提取过程是否使酶失活
lz问为什么说是测定的过氧化氢残余量，看来lz还没有搞清楚实验原理。
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4楼2014-04-02 12:15:19
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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-04-02 12:15:19
我仔细看了你的反应体系，lz应该再确定下反应体系中各成分的含量
1、DTT，会还原酶的二硫键，此处可以不加
2、过氧化氢浓度，生化实验书上的反应体系是3ml 15mM过氧化氢 + 0.1 ml酶液，你加20mmol过氧化氢太多太多 ...

刚刚又看了实验书，确实是检测过氧化氢含量，请问一下，实验过程中哪些情况会导致酶失活呢。。。？？？

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5楼2014-04-02 21:22:32
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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-04-02 12:15:19
我仔细看了你的反应体系，lz应该再确定下反应体系中各成分的含量
1、DTT，会还原酶的二硫键，此处可以不加
2、过氧化氢浓度，生化实验书上的反应体系是3ml 15mM过氧化氢 + 0.1 ml酶液，你加20mmol过氧化氢太多太多 ...

DDT不加，我用什么当提取液呢？？？pvpp和磷酸缓冲液么

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6楼2014-04-02 21:25:31
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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-04-02 12:15:19
我仔细看了你的反应体系，lz应该再确定下反应体系中各成分的含量
1、DTT，会还原酶的二硫键，此处可以不加
2、过氧化氢浓度，生化实验书上的反应体系是3ml 15mM过氧化氢 + 0.1 ml酶液，你加20mmol过氧化氢太多太多 ...

DTT不加，我用什么当提取液呢？？？pvpp和磷酸缓冲液么

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7楼2014-04-02 21:28:15
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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-04-03 09:29:14
酶提取液就用PBS+pvp就好
酶失活的可能很多，在实验中尽量注意，比如提取液要预冷，研磨使用液氮或在冰上进行，离心要4度，混匀不能太剧烈，等等等

我直接是冰浴匀浆。。。我感觉药品什么都没问题。。。。问题应该出在酶提取上。。。

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9楼2014-04-03 10:52:05
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晨萍之水

银虫 (正式写手)
3楼正解   酶活用紫外是个细致活。  你可以尝试一下电泳
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~勇敢和执着也是一种霸气~
10楼2014-04-03 11:00:54
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