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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)

[求助] 测苹果CAT酶活性 已有1人参与

今天测CAT酶活性,使用0.1M PH7.5的磷酸缓冲液,提取液是用77mgDTT和5%pvpp混合定容至100ml.最后测定使用20mmol的过氧化氢溶液加上100微升酶提取液。吸光值一直不变。。。。。保持一个值为什么?????是什么原因啊???!!!求大神解答

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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

酶提取液就用PBS+pvp就好
酶失活的可能很多,在实验中尽量注意,比如提取液要预冷,研磨使用液氮或在冰上进行,离心要4度,混匀不能太剧烈,等等等
8楼2014-04-03 09:29:14
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
lz是用测定过氧化氢的残余量来判定的吧,比色皿是用的石英的吗?过氧化氢过期了吗?
2楼2014-04-01 14:55:00
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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-04-01 14:55:00
lz是用测定过氧化氢的残余量来判定的吧,比色皿是用的石英的吗?过氧化氢过期了吗?

过氧化氢没过期,比色mi是石英的,第一次做,为什么说我是测过氧化氢残余量呢?按理说吸光值应该一直下降。。。。我的真是不知道怎么回事

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3楼2014-04-02 10:54:20
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小小鱼泪了: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 很好啊,真的很感谢 2014-04-03 10:53:07
我仔细看了你的反应体系,lz应该再确定下反应体系中各成分的含量
1、DTT,会还原酶的二硫键,此处可以不加
2、过氧化氢浓度,生化实验书上的反应体系是3ml 15mM过氧化氢 + 0.1 ml酶液,你加20mmol过氧化氢太多太多了
3、提取的酶的浓度是否合适,提取过程是否使酶失活
lz问为什么说是测定的过氧化氢残余量,看来lz还没有搞清楚实验原理。
4楼2014-04-02 12:15:19
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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-04-02 12:15:19
我仔细看了你的反应体系,lz应该再确定下反应体系中各成分的含量
1、DTT,会还原酶的二硫键,此处可以不加
2、过氧化氢浓度,生化实验书上的反应体系是3ml 15mM过氧化氢 + 0.1 ml酶液,你加20mmol过氧化氢太多太多 ...

刚刚又看了实验书,确实是检测过氧化氢含量,请问一下,实验过程中哪些情况会导致酶失活呢。。。???

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5楼2014-04-02 21:22:32
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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-04-02 12:15:19
我仔细看了你的反应体系,lz应该再确定下反应体系中各成分的含量
1、DTT,会还原酶的二硫键,此处可以不加
2、过氧化氢浓度,生化实验书上的反应体系是3ml 15mM过氧化氢 + 0.1 ml酶液,你加20mmol过氧化氢太多太多 ...

DDT不加,我用什么当提取液呢???pvpp和磷酸缓冲液么

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6楼2014-04-02 21:25:31
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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-04-02 12:15:19
我仔细看了你的反应体系,lz应该再确定下反应体系中各成分的含量
1、DTT,会还原酶的二硫键,此处可以不加
2、过氧化氢浓度,生化实验书上的反应体系是3ml 15mM过氧化氢 + 0.1 ml酶液,你加20mmol过氧化氢太多太多 ...

DTT不加,我用什么当提取液呢???pvpp和磷酸缓冲液么

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7楼2014-04-02 21:28:15
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小小鱼泪了

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-04-03 09:29:14
酶提取液就用PBS+pvp就好
酶失活的可能很多,在实验中尽量注意,比如提取液要预冷,研磨使用液氮或在冰上进行,离心要4度,混匀不能太剧烈,等等等

我直接是冰浴匀浆。。。我感觉药品什么都没问题。。。。问题应该出在酶提取上。。。

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9楼2014-04-03 10:52:05
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晨萍之水

银虫 (正式写手)

3楼正解   酶活用紫外是个细致活。  你可以尝试一下电泳
~勇敢和执着也是一种霸气~
10楼2014-04-03 11:00:54
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