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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 可以往一个细胞内转染两次吗
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nanshi304

新虫 (初入文坛)

[求助] 可以往一个细胞内转染两次吗 已有1人参与

不知道可 不可以先转进一个基因让细胞过表达，然而再转siRNA干扰另一个蛋白，可不可以，如果可以，是同时转进去还是第一个质粒转进去后多少个小时再转干扰RNA?
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1楼 2014-03-31 11:13:57
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
nanshi304(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-03-31 12:44:42
这个可以的
如果是用Lipofectamine 2000，可以先转siRNA，等24h后再转表达蛋白的质粒
一般siRNA可以72h，蛋白48h足够了，这样时间比较好
而且siRNA转染细胞要求密度不太高，这样长得第二天正好转表达蛋白质质粒
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2楼2014-03-31 11:58:30
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nanshi304

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-31 11:58:30
这个可以的
如果是用Lipofectamine 2000，可以先转siRNA，等24h后再转表达蛋白的质粒
一般siRNA可以72h，蛋白48h足够了，这样时间比较好
而且siRNA转染细胞要求密度不太高，这样长得第二天正好转表达蛋白质质粒

我还以为6h就可以了，那说明书上说的转染4-6h是说的转染进去还没表达吗？一般质粒转进细胞多久后开始表达啊，还有siRNA要多久发挥干扰效应啊？往一个细胞转染两次会不会对细胞有毒害作用啊
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3楼2014-04-02 22:22:49
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-04-03 19:23:48
nanshi304: 金币+3, ★★★很有帮助 2014-04-04 21:04:58
各种纠结。。。
转质粒一般默认48h，转siRNA一般默认72h
这里考虑的更多的并不是质粒DNA和siRNA的稳定性，这两个玩意稳定着呢，一周没问题。
考虑的是最大效率化，lippo转质粒，细胞密度要求90%，转siRNA，细胞密度低一点，所以这么长时间是一盘细胞的生长极限。你再养，细胞死了。
你要两次转染，转染肯定有细胞毒性，耐受性不好的细胞可能转一次就活得不咋地了，这个是你需要提前优化的。
这只是默认，尤其是siRNA。
经常看见有报道，按照默认的72h检测siRNA效果，结果发现定了一堆siRNA，效果都不好，最后发现原来是48h或者24h效果最好，原因不明。
所以如果你的这条siRNA没有做过预实验，先不要搞这么复杂的
转几个小dish，收一个时间梯度，看看什么时候效果最好。
把这些预实验条件先摸好了，再来转两次。
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4楼2014-04-03 09:25:13
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

忘了
你说的4-6h
理论上应该是“Lippo-核酸”这个liposome的稳定最长时间
意思就是说，过了这个时间，这个liposome可能就不存在了，可以换液了，尤其是对lippo有毒性的时候，早换液早好。
你可以看见，说明书上说把lippo和DNA/RNA混好之后，说要放20min，然后还加了一句，这玩意可以稳定至少6h。
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5楼2014-04-03 09:28:03
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nanshi304

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-04-03 09:25:13
各种纠结。。。
转质粒一般默认48h，转siRNA一般默认72h
这里考虑的更多的并不是质粒DNA和siRNA的稳定性，这两个玩意稳定着呢，一周没问题。
考虑的是最大效率化，lippo转质粒，细胞密度要求90%，转siRNA，细胞密 ...

太谢谢你了，高手一个诶，谢谢你的热心帮助！小生还有个问题，就是转染质粒为48h后检测效果挺好的，如果我还要对细胞加药处理12h，那我是在转染48h加药还是在转染36h后加药啊。不知道我有没有说清楚
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6楼2014-04-04 21:09:05
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hehelmd

木虫 (小有名气)
过表达质粒有的24小时表达已经很好了。如果效率高，转染后长满你完全可以在分一次细胞，然后再进行下一次转染
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一直向上
7楼2014-04-09 01:22:48
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wwkuaile

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by nanshi304 at 2014-04-04 21:09:05
太谢谢你了，高手一个诶，谢谢你的热心帮助！小生还有个问题，就是转染质粒为48h后检测效果挺好的，如果我还要对细胞加药处理12h，那我是在转染48h加药还是在转染36h后加药啊。不知道我有没有说清楚...

我也想问
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8楼2014-04-17 16:29:03
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dealer

铜虫 (初入文坛)
可以的，同学用英格恩生物的转染试剂，好像可以共转，但是肯定没有分着转的效果好，可以申请试用装具体试试效果如何
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9楼2015-04-14 10:28:04
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
细胞转染，两次应该可行的，但是没做过啊。。。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-08-19 10:59:43
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