应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于载体改造
81/1返回列表
查看: 1800  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lixg

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于载体改造 已有2人参与

我要进行载体改造，将载体A中的一个片段切下来，装到载体B中。由于酶切位点不很合适，只能做如下平末端连接。拟定下列操作，请高手看看合适不？如不合适，如何改进？
1. 将载体A用AscI和SpeI酶切，乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端补平，电泳，切胶，回收纯化约目的片段。
2. 将载体B用BamHI酶切（位于多克隆位点内），乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端削平，过柱子纯化、去磷酸化。
3. 将上述1.2所得产物连接，转化。
主要请高手们参谋参谋第一步和第二步是否合适。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-03-08 18:04:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-08 22:02:08
lixg: 金币+5, ★★★很有帮助, 嗯，按照我的方案如果做不出来，就用你的方案做一下。毕竟平端不好连。非常感谢！ 2014-03-09 09:55:09
通过PCR克隆，把载体A的那个片段切下来。这个方案不行？

1、设计引物，5‘端添加所需的酶切位点和保护碱基。
2、PCR扩增（载体A为模版），产物纯化、酶切回收目的片段。
3、载体B酶切回收目的片段。
4、上述2、3的目的片段连接，转化，摇菌。
5、菌落PCR和酶切验证大小后，送测序，看是否有载体A是否有PCR导致的碱基突变。

注：9kb全基因的互补载体，我们也是引物新增酶切位点分为一段段地构建好，再连接在一起的。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

lixg
2楼2014-03-08 20:40:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-03-08 22:02:16
你的第一步和第二步看起来没问题，但实际操作尤其是连接估计不好做。
赞一下 回复此楼
hehe
3楼2014-03-08 21:26:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-08 21:26:53
你的第一步和第二步看起来没问题，但实际操作尤其是连接估计不好做。

非常感谢！以前没做过这样的方法，听你这么说就放心了。
赞一下 回复此楼
4楼2014-03-09 09:58:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ytetyio09

新虫 (正式写手)
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
赞一下 回复此楼
5楼2014-03-25 18:10:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ytetyio09

新虫 (正式写手)
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
赞一下 回复此楼
6楼2014-03-25 19:13:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-03-08 20:40:43
通过PCR克隆，把载体A的那个片段切下来。这个方案不行？

1、设计引物，5‘端添加所需的酶切位点和保护碱基。
2、PCR扩增（载体A为模版），产物纯化、酶切回收目的片段。
3、载体B酶切回收目的片段。
4、上述2 ...

你的办法可行，非常感谢！
赞一下 回复此楼
7楼2014-03-27 18:25:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ytetyio09 at 2014-03-25 18:10:02
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256

感谢您的热心，非常感谢！
赞一下 回复此楼
8楼2014-03-27 18:25:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lixg 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085602 289分求调剂 +8 WWW西西弗斯 2026-03-24 8/400 2026-03-26 16:33 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿北京化工大学材料与化工（085600）296求调剂 +9 稻妻小编 2026-03-26 9/450 2026-03-26 16:16 by 不吃魚的貓
[材料工程] 一志愿C9材料与化工专业总分300求调剂 +5 曼111 2026-03-24 6/300 2026-03-26 13:04 by 13756423260
[考研] 299求调剂 +4 15188958825 2026-03-25 4/200 2026-03-25 22:56 by 418490947
[考研] 07化学303求调剂 +5 睿08 2026-03-25 5/250 2026-03-25 22:46 by 418490947
[考研] 290分调剂求助 +3 吉祥止止陈 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:58 by barlinike
[考研] 材料学硕333求调剂 +4 北道巷 2026-03-24 4/200 2026-03-25 14:16 by mapenggao
[考研] 359求调剂 +3 王了个楠 2026-03-25 3/150 2026-03-25 12:50 by Dyhoer
[考研] 285求调剂 +3 AZMK 2026-03-24 3/150 2026-03-25 12:23 by userper
[考研] 0703化学求调剂 +6 奶油草莓. 2026-03-22 7/350 2026-03-25 10:00 by shangxh
[考研] 一志愿北化315 求调剂 +3 akrrain 2026-03-24 3/150 2026-03-24 19:35 by 了了了了。。
[考研] 一志愿山东大学药学学硕求调剂 +3 开开心心没烦恼 2026-03-23 4/200 2026-03-24 00:06 by 开开心心没烦恼
[考研] 341求调剂(一志愿湖南大学070300) +5 番茄头--- 2026-03-22 6/300 2026-03-23 23:45 by Txy@872106
[考研] 327求调剂 +5 prayer13 2026-03-23 5/250 2026-03-23 22:11 by 星空星月
[考研] 384求调剂 +3 子系博 2026-03-22 6/300 2026-03-23 21:45 by 子系博
[考研] 接收2026硕士调剂(学硕+专硕) +4 allen-yin 2026-03-23 6/300 2026-03-23 15:04 by 汪！？！
[考研] 求老师收我 +3 zzh16938784 2026-03-23 3/150 2026-03-23 12:56 by ztnimte
[考研] 319求调剂 +4 小力气珂珂 2026-03-20 4/200 2026-03-22 15:53 by ColorlessPI
[考研] 275求调剂 +6 shansx 2026-03-22 8/400 2026-03-22 15:27 by barlinike
[考研] 求助 +5 梦里的无言 2026-03-21 6/300 2026-03-21 17:51 by 学员8dgXkO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭