应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于载体改造
51/1返回列表
查看: 1792  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于载体改造 已有2人参与

我要进行载体改造，将载体A中的一个片段切下来，装到载体B中。由于酶切位点不很合适，只能做如下平末端连接。拟定下列操作，请高手看看合适不？如不合适，如何改进？
1. 将载体A用AscI和SpeI酶切，乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端补平，电泳，切胶，回收纯化约目的片段。
2. 将载体B用BamHI酶切（位于多克隆位点内），乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端削平，过柱子纯化、去磷酸化。
3. 将上述1.2所得产物连接，转化。
主要请高手们参谋参谋第一步和第二步是否合适。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-03-08 18:04:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-08 21:26:53
你的第一步和第二步看起来没问题，但实际操作尤其是连接估计不好做。

非常感谢！以前没做过这样的方法，听你这么说就放心了。
赞一下 回复此楼
4楼2014-03-09 09:58:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-08 22:02:08
lixg: 金币+5, ★★★很有帮助, 嗯，按照我的方案如果做不出来，就用你的方案做一下。毕竟平端不好连。非常感谢！ 2014-03-09 09:55:09
通过PCR克隆，把载体A的那个片段切下来。这个方案不行？

1、设计引物，5‘端添加所需的酶切位点和保护碱基。
2、PCR扩增（载体A为模版），产物纯化、酶切回收目的片段。
3、载体B酶切回收目的片段。
4、上述2、3的目的片段连接，转化，摇菌。
5、菌落PCR和酶切验证大小后，送测序，看是否有载体A是否有PCR导致的碱基突变。

注：9kb全基因的互补载体，我们也是引物新增酶切位点分为一段段地构建好，再连接在一起的。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

lixg
2楼2014-03-08 20:40:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-03-08 22:02:16
你的第一步和第二步看起来没问题，但实际操作尤其是连接估计不好做。
赞一下 回复此楼
hehe
3楼2014-03-08 21:26:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ytetyio09

新虫 (正式写手)
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
赞一下 回复此楼
5楼2014-03-25 18:10:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 高分子化学与物理调剂 +6 好好好1233 2026-02-28 12/600 2026-03-01 19:48 by 好好好1233
[考研] 材料学硕318求调剂 +9 February_Feb 2026-03-01 11/550 2026-03-01 19:47 by 无懈可击111
[考研] 一志愿中南大学理学化学 +4 15779376950 2026-03-01 5/250 2026-03-01 19:00 by Fff-1
[考研] 272求调剂 +6 材紫有化 2026-02-28 6/300 2026-03-01 18:58 by 18137688336
[考博] 26申博 +4 想申博！ 2026-02-26 6/300 2026-03-01 17:32 by 想申博！
[考研] 0856材料求调剂 +4 麻辣鱿鱼 2026-02-28 4/200 2026-03-01 16:51 by caszguilin
[考研] 化工专硕342，一志愿大连理工大学，求调剂 +3 kyf化工 2026-02-28 4/200 2026-03-01 16:49 by yywzz
[基金申请] 刚录用，没有期刊号，但是在线可看的论文可以放为代表作吗 10+3 arang1 2026-03-01 3/150 2026-03-01 16:43 by babero
[考研] 307求调剂 +5 wyyyqx 2026-03-01 5/250 2026-03-01 15:21 by Fff-1
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-02-28 7/350 2026-03-01 15:14 by wjLi2017
[考研] 材料工程274求调剂 +3 Lilithan 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:58 by ms629
[考研] 求调剂 +6 repeatt?t 2026-02-28 6/300 2026-03-01 14:37 by Sakura绘
[考研] 课题组接收材料类调剂研究生 +3 gaoxiaoniuma 2026-02-28 4/200 2026-03-01 14:30 by jjj三跨
[考研] 295复试调剂 +3 简木ChuFront 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:27 by zzxw520th
[考研] 302材料工程求调剂 +4 Doleres 2026-03-01 5/250 2026-03-01 11:52 by liqiongjy
[考研] 调剂 +3 简木ChuFront 2026-02-28 3/150 2026-03-01 11:46 by 王伟要上岸啊
[硕博家园] 博士自荐 +6 科研狗111 2026-02-26 10/500 2026-03-01 10:02 by 科研狗111
[考研] 材料调剂 +4 爱擦汗的可乐冰 2026-02-28 4/200 2026-03-01 00:38 by 猫猫球alter
[基金申请] 面上模板改不了页边距吧？ +5 ieewxg 2026-02-25 6/300 2026-03-01 00:10 by addressing
[考研] 264求调剂 +3 巴拉巴拉根556 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:31 by gaoxiaoniuma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭