| 查看: 1791 | 回复: 7 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
lixg铁杆木虫 (正式写手)
|
[求助]
关于载体改造 已有2人参与
|
|
|
我要进行载体改造，将载体A中的一个片段切下来，装到载体B中。由于酶切位点不很合适，只能做如下平末端连接。拟定下列操作，请高手看看合适不？如不合适，如何改进？ 1. 将载体A用AscI和SpeI酶切，乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端补平，电泳，切胶，回收纯化约目的片段。 2. 将载体B用BamHI酶切（位于多克隆位点内），乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端削平，过柱子纯化、去磷酸化。 3. 将上述1.2所得产物连接，转化。 主要请高手们参谋参谋第一步和第二步是否合适。 |
回复此楼» 猜你喜欢
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有223人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于双元载体pCAMBIA1300的问题,高手解答一下
已经有8人回复
- 投一篇关于药物载体的文章
已经有11人回复
- 关于使载体平末端环化的问题
已经有14人回复
- 载体改性是什么意思啊？
已经有4人回复
- 关于T载体连接验证后测序不对
已经有3人回复
- 有谁改造过pPIC9K载体吗（用GAP替换AOX1启动子）且成功的吗
已经有5人回复
- 二氧化锆改性氧化铝载体
已经有4人回复
- 关于ZrO2载体的购买
已经有3人回复
- 关于分子筛载体孔径的问题
已经有7人回复
- 关于SiRNA表达载体构建的问题
已经有9人回复
- 关于pet28克隆载体
已经有5人回复
- 【求助/交流】拟改造一个表达载体，请大家帮忙分析下如何进行
已经有3人回复
- 【求助/交流】关于T载体连接问题
已经有22人回复
- 【求助/交流】求助关于载体多克隆位点改造
已经有8人回复
lixg
铁杆木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 61 (初中生)
- 金币: 7627.1
- 散金: 1
- 红花: 7
- 帖子: 591
- 在线: 106.4小时
- 虫号: 859417
- 注册: 2009-09-29
- 专业: 发育生物学
4楼2014-03-09 09:58:36
Lau_Kimura
铁虫 (正式写手)
- 应助: 41 (小学生)
- 金币: 20.5
- 散金: 189
- 红花: 19
- 帖子: 320
- 在线: 119.1小时
- 虫号: 2468570
- 注册: 2013-05-17
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-08 22:02:08
lixg: 金币+5, ★★★很有帮助, 嗯，按照我的方案如果做不出来，就用你的方案做一下。毕竟平端不好连。非常感谢！ 2014-03-09 09:55:09
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-08 22:02:08
lixg: 金币+5, ★★★很有帮助, 嗯，按照我的方案如果做不出来，就用你的方案做一下。毕竟平端不好连。非常感谢！ 2014-03-09 09:55:09
|
通过PCR克隆，把载体A的那个片段切下来。这个方案不行？ 1、设计引物，5‘端添加所需的酶切位点和保护碱基。 2、PCR扩增（载体A为模版），产物纯化、酶切回收目的片段。 3、载体B酶切回收目的片段。 4、上述2、3的目的片段连接，转化，摇菌。 5、菌落PCR和酶切验证大小后，送测序，看是否有载体A是否有PCR导致的碱基突变。 注：9kb全基因的互补载体，我们也是引物新增酶切位点分为一段段地构建好，再连接在一起的。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
lixg2楼2014-03-08 20:40:43
lvbobo823
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 363 (硕士)
- 金币: 7753.3
- 散金: 15
- 红花: 9
- 帖子: 751
- 在线: 189.4小时
- 虫号: 819723
- 注册: 2009-07-31
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
3楼2014-03-08 21:26:53
5楼2014-03-25 18:10:02
10