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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于载体改造
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 关于载体改造 已有2人参与

我要进行载体改造，将载体A中的一个片段切下来，装到载体B中。由于酶切位点不很合适，只能做如下平末端连接。拟定下列操作，请高手看看合适不？如不合适，如何改进？
1. 将载体A用AscI和SpeI酶切，乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端补平，电泳，切胶，回收纯化约目的片段。
2. 将载体B用BamHI酶切（位于多克隆位点内），乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端削平，过柱子纯化、去磷酸化。
3. 将上述1.2所得产物连接，转化。
主要请高手们参谋参谋第一步和第二步是否合适。
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1楼 2014-03-08 18:04:24
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-03-08 22:02:16
你的第一步和第二步看起来没问题，但实际操作尤其是连接估计不好做。
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hehe
3楼2014-03-08 21:26:53
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-08 22:02:08
lixg: 金币+5, ★★★很有帮助, 嗯，按照我的方案如果做不出来，就用你的方案做一下。毕竟平端不好连。非常感谢！ 2014-03-09 09:55:09
通过PCR克隆，把载体A的那个片段切下来。这个方案不行？

1、设计引物，5‘端添加所需的酶切位点和保护碱基。
2、PCR扩增（载体A为模版），产物纯化、酶切回收目的片段。
3、载体B酶切回收目的片段。
4、上述2、3的目的片段连接，转化，摇菌。
5、菌落PCR和酶切验证大小后，送测序，看是否有载体A是否有PCR导致的碱基突变。

注：9kb全基因的互补载体，我们也是引物新增酶切位点分为一段段地构建好，再连接在一起的。
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lixg
2楼2014-03-08 20:40:43
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-08 21:26:53
你的第一步和第二步看起来没问题，但实际操作尤其是连接估计不好做。

非常感谢！以前没做过这样的方法，听你这么说就放心了。
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4楼2014-03-09 09:58:36
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ytetyio09

新虫 (正式写手)
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
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5楼2014-03-25 18:10:02
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