24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

lixg

铁杆木虫 (正式写手)

MolEPI: 1
应助: 61 (初中生)
金币: 7627.1
散金: 1
红花: 7
帖子: 591
在线: 106.4小时
虫号: 859417
注册: 2009-09-29
专业: 发育生物学

[求助] 关于载体改造已有2人参与

我要进行载体改造，将载体A中的一个片段切下来，装到载体B中。由于酶切位点不很合适，只能做如下平末端连接。拟定下列操作，请高手看看合适不？如不合适，如何改进？
1. 将载体A用AscI和SpeI酶切，乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端补平，电泳，切胶，回收纯化约目的片段。
2. 将载体B用BamHI酶切（位于多克隆位点内），乙醇沉淀，ddH2O回溶，用T4 DNA polymerase末端削平，过柱子纯化、去磷酸化。
3. 将上述1.2所得产物连接，转化。
主要请高手们参谋参谋第一步和第二步是否合适。

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

关于双元载体pCAMBIA1300的问题,高手解答一下已经有8人回复
投一篇关于药物载体的文章已经有11人回复
关于使载体平末端环化的问题已经有14人回复
载体改性是什么意思啊？已经有4人回复
关于T载体连接验证后测序不对已经有3人回复
有谁改造过pPIC9K载体吗（用GAP替换AOX1启动子）且成功的吗已经有5人回复
二氧化锆改性氧化铝载体已经有4人回复
关于ZrO2载体的购买已经有3人回复
关于分子筛载体孔径的问题已经有7人回复
关于SiRNA表达载体构建的问题已经有9人回复
关于pet28克隆载体已经有5人回复
【求助/交流】拟改造一个表达载体，请大家帮忙分析下如何进行已经有3人回复
【求助/交流】关于T载体连接问题已经有22人回复
【求助/交流】求助关于载体多克隆位点改造已经有8人回复

1楼 2014-03-08 18:04:24

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

ytetyio09

新虫 (正式写手)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 110.7
散金: 142
红花: 10
帖子: 554
在线: 195.1小时
虫号: 772091
注册: 2009-05-16
专业: 生物防治

可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256

赞一下

回复此楼

6楼2014-03-25 19:13:16

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

查看全部 8 个回答

Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

应助: 41 (小学生)
金币: 20.5
散金: 189
红花: 19
帖子: 320
在线: 119.1小时
虫号: 2468570
注册: 2013-05-17
性别: GG
专业: 作物分子育种

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-08 22:02:08
lixg: 金币+5, ★★★很有帮助, 嗯，按照我的方案如果做不出来，就用你的方案做一下。毕竟平端不好连。非常感谢！ 2014-03-09 09:55:09

通过PCR克隆，把载体A的那个片段切下来。这个方案不行？

1、设计引物，5‘端添加所需的酶切位点和保护碱基。
2、PCR扩增（载体A为模版），产物纯化、酶切回收目的片段。
3、载体B酶切回收目的片段。
4、上述2、3的目的片段连接，转化，摇菌。
5、菌落PCR和酶切验证大小后，送测序，看是否有载体A是否有PCR导致的碱基突变。

注：9kb全基因的互补载体，我们也是引物新增酶切位点分为一段段地构建好，再连接在一起的。

赞一下

回复此楼