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不倒翁陈露

金虫 (小有名气)

budaoweng

[求助] 湿转转膜条件 已有2人参与

目的蛋白是23KD的,电泳条件是:15%的分离胶,1.5mm的玻璃板(上样量较大100ug),先80V把胶压平,后110V,2h,从Marker的条带来看是很好的,
        湿转法转膜,条件:250mA,冰上60---70min,用甲醇活化了的PVDF膜,湿转液都是新配置的,每次曝光的目的条带都不是很清楚,很浅,
是不是我的湿转条件有问题?还是别的方面操作不对呢?含泪求助啊
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yipan

铜虫 (职业作家)


【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
不倒翁陈露: 金币+2, ★有帮助 2014-06-07 09:03:35
恒流,用300~350mA转移1个小时
恒压,用100V 转移1小时
2楼2014-03-07 16:15:38
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yuweiguo138

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
不倒翁陈露: 金币+3 2014-06-07 09:03:49
有没有延长曝光时间?爆的更久点。转膜的话23KD,你那个条件肯定转上去了,看看滤纸上有无marker,不要转过了。一抗的浓度摸索过吗?是不是太低了?如果有阳性对照,带个阳性对照的样本,看看是不是本身蛋白的表达量就低。你最好要把自己曝光的照片发出来,不然不好分析。
3楼2014-03-07 17:28:05
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不倒翁陈露

金虫 (小有名气)

budaoweng

引用回帖:
2楼: Originally posted by yipan at 2014-03-07 16:15:38
恒流,用300~350mA转移1个小时
恒压,用100V 转移1小时

250mA,1个小时应该可以吧,300mA感觉太大了
为了遇见更好的自己,加油!
4楼2014-03-10 08:07:16
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不倒翁陈露

金虫 (小有名气)

budaoweng

引用回帖:
3楼: Originally posted by yuweiguo138 at 2014-03-07 17:28:05
有没有延长曝光时间?爆的更久点。转膜的话23KD,你那个条件肯定转上去了,看看滤纸上有无marker,不要转过了。一抗的浓度摸索过吗?是不是太低了?如果有阳性对照,带个阳性对照的样本,看看是不是本身蛋白的表达量 ...

本身蛋白的表达量就低,一抗的浓度正在摸索中,很难作出很好的条带,不具有重复性,背景很深,目的条带很浅
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5楼2014-03-10 08:09:20
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