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DNA中加入RNase A后出现严重降解 已有7人参与
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前几天有一批DNA样品准备建库测序，质检时发现有RNA污染，建库之前需要处理。咨询了别人，说按照100ulDNA加2ulRNase A，37度水浴半小时即可。然后我就照做了，中午吃饭前放到水浴锅里的，午休结束后去取，水浴时间2个多小时，一测浓度吓死了，本来几十上百ng/ul的样品，现在浓度都只有1不到。以为是我的qubit HS的试剂出问题了，换了台qubit，换了别人的qubit HS的试剂，测了几个样品还是那么低。 喊来了几个实验室的熟手，均说没见过这种情况，按理说Rnase不该对DNA有作用，建议把样品跑个电泳看看，跑完电泳之后发现一点条带都看不到了，看来的确是降解掉了。 从此我们开始了探索原因之路。首先给天根打电话咨询Rnase A里是不是混有Dnase，得到的答复是没有混有Dnase。（使用的Rnase A是tiangen的100mg/ml包装，货号RT405-12。DNA提取用的是tiangen的试剂盒，洗脱液是TE） 1、 上网查了些资料，有人说Rnase A里混有少量的Dnase，使用之前需要将Rnase A80度水浴10分钟，理由是Rnase A非常稳定，高温高压下不会失活，但是Dnase 在80度水浴10分钟就会不可逆失活。但是我想这么简单的东西，商品化的Rnase A肯定是已经处理过的，而且天根的技术支持跟我说他们的Rnase A是纯的。但是抱着怀疑的态度，我在后续的实验中也考虑到了这个因素。 2、 咨询了另一个朋友，说处理RNA污染的方法是80ul样品中加0.4ul的Rnase A，37度水浴30分钟。 3、 网上查到资料TE缓冲液中含有EDTA，是Dnase的抑制剂。按理说微量的Dnase在TE缓冲液中是不会有活性的。 基于对以上三个方面的质疑，我设计了如下实验： 第一组：DNA样品起始浓度4.84ng/ul 1、按2%体积加入我自己的RNase A（tiangen RT405-12） ，37度水浴，1小时浓度1.24，2 小时浓度0.584 2、按2%体积加入朋友那里借的RNase A ，37度水浴，1小时浓度0.76，2小时浓度0.698 3、不加RNase，37度水浴，1小时浓度5.04，2小时浓度5.06 得出结论：不是我买的Rnase A的品牌问题，只要加入Rnase就会降解DNA，不加Rnase 是不会降解的。 第二组实验： 先取部分RNase A 85度水浴11分钟处理 1号样品水浴前浓度5.62，取50ul样本，加1ul处理后的RNase A，37度水浴1小时后测浓度 0.238 2号样品水浴前浓度5.2，取40ul样本，加0.2ul处理后的RNase A，37度水浴1小时后测浓度 1.84 3号样品水浴前浓度4.86，取40ul样本，加0.2ul未处理的RNase A，37度水浴1小时后测浓度 0.302 本想通过这个实验证明DNA降解是因为RNase中混有DNase，但是结果不符合预期。 可能的原因是： 1、RNase中的确含有DNase，但是85度水浴11分钟并不能使DNase灭活，这与百度百科提供的信息不符（80℃、10分钟热处理后不可逆失活） 2、RNase A本身可以降解DNA，这也与百度百科的结果不符（RNase A是一种被详细研究和具有广泛应用的核酸内切酶。RNase A 对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。） 3、RNase A中含有某种未知因素对DNA有降解作用 声明几个问题： 1、 样品提取时用的是天根的组织DNA试剂盒提取的，提取时未用RNA酶处理，洗脱液是TE。 2、 所有浓度都是用qubit HS测的。 3、 为什么没有实验水浴37度半小时：因为我觉得37度与室温较接近，只要加了Rnase A会降解DNA，半小时与1小时差别不会很大。另外Rnase A加在DNA样品中，如果你不处理掉降解DNA的因素的话，每次从冰箱里拿出来化冻时的温度也不会和37度差很远，对于保存时间按月按年计算的DNA样品来说，累积的降解效果肯定大于水浴半小时的效果。因此重点是找出Rnase A使DNA降解的因素。 实验结果不符合理论预期啊，到底是什么原因造成DNA降解的呢？各位大神有遇到这种情况吗？ |
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kx444555: 金币+5, 应助指数+1, 鼓励交流 2014-05-26 18:20:27
silicare: MolEPI+1 2014-05-27 13:09:39
kx444555: 金币+5, 应助指数+1, 鼓励交流 2014-05-26 18:20:27
silicare: MolEPI+1 2014-05-27 13:09:39
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话说你是用qubit HS定量，那咱就不怀疑你定量的结论了，我没有用过qubit HS，不知道qubit DNA对DNA duplex最小敏感是多长，对DNA和RNA的区分度有多大。 但是，RNaseA不管在什么情况下都是不可能切DNA的，这点几乎不可能质疑，RNaseA切割RNA是基于2‘-OH的，且不说DNA，就是2‘-O-Me修饰的RNA都不可能切开。 RNaseA因为在牛胰腺异常丰富，是一种分泌消化酶，所以一直以来商业化的RNaseA直接从牛胰分离，没有进行重组表达。胰腺是最丰富的消化腺，所以RNaseA污染一点其他的消化酶是有可能的。 关于这一点，科学趣闻就是，制造热狗的Armour&Co. 纯化了公斤级的RNaseA，任何科学家只要申请，可以免费赠送10 mg。 早期的RNaseA用粉末卖，回家跟普通试剂一样称重，溶解，然后煮沸灭活其他酶。 这是基于RNaseA的另一项科学传奇，RNaseA是蛋白科学史上，“蛋白质一级结构决定高级结构”的来源，人类第一次研究蛋白质变复性，就是针对RNaseA，这个酶，被高温打破结构之后，降温可以很好的恢复结构，恢复酶活。【饶毅同志说，伟大的中国人民在人工合成结晶牛胰岛素的时候，杰出的一代人民科学家邹承鲁进行的牛胰岛素A、B链拆分重组实验，是比RNaseA更早可以得到此结论的研究，可惜没有发表】 现在买来的RNaseA，还是这个程序过来的，只不过交给公司完成了，但是，公司，就有好有坏了。。。 |
6楼2014-05-26 09:41:53
5楼2014-05-25 11:50:36
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