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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光PCR曲线图求助
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a3200649

铜虫 (正式写手)

[求助] 荧光PCR曲线图求助 已有1人参与

最近做了个细菌的荧光PCR检测，实验数据图如下，
荧光PCR曲线图求助
1.jpg
我针对该细菌的23SrDNA 设计了引物探针，但从实验结果来看是阴性，没有扩增出我需要的序列，我想知道除了我的引物和探针出现了错误，我的反应体系和反应条件出现错误了会不会导致上面的曲线？

[ Last edited by a3200649 on 2014-1-17 at 23:07 ]
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希望大家多多交流
1楼 2014-01-17 23:01:58
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a3200649

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-18 02:08:48
你这是没有P出来，所以荧光值也很低。你的PCR是否设立了阳性对照？模板是cDNA吗？你的引物用gDNA为模板做普通PCR是否能P出来？

我没有阳性对照，还没做标准品。我提取细菌菌落基因组的DNA，然后模板是gDNA,以前做普通pcr然后电泳，能看到好几条条带，这次做的荧光PCR我就想看看我设计的引物探针能不能把需要的序列扩出来（我需要的序列是细菌23SrDNA,探针序列也是根据其设计的）
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希望大家多多交流
3楼2014-01-18 10:06:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2014-01-18 16:10:40
你这是没有P出来，所以荧光值也很低。你的PCR是否设立了阳性对照？模板是cDNA吗？你的引物用gDNA为模板做普通PCR是否能P出来？
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2楼2014-01-18 02:08:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by a3200649 at 2014-01-18 10:06:19
我没有阳性对照，还没做标准品。我提取细菌菌落基因组的DNA，然后模板是gDNA,以前做普通pcr然后电泳，能看到好几条条带，这次做的荧光PCR我就想看看我设计的引物探针能不能把需要的序列扩出来（我需要的序列是细菌 ...

如果做普通PCR就有好几条带，说明引物的特异性不好或者是PCR退火温度不合适，做定量需要引物的特异性非常，如果引物达不到要求，需要重新设计。
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4楼2014-01-18 10:16:09
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