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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 合成的引物直接退火形成粘性末端后连入载体
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zb0806030

银虫 (小有名气)

[求助] 合成的引物直接退火形成粘性末端后连入载体 已有5人参与

求助：有没有虫友做过合成两段互补的引物直接退火形成粘性末端以后再连入载体的？
请问具体的方法是怎样的呢？都需要加什么东西退火，反应应该怎么设置条件？
谢谢啦！
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厚积薄发
1楼 2013-12-18 16:47:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
zb0806030: 金币+4, ★★★★★最佳答案 2013-12-24 22:11:49
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:53:31
a. 把待退火的DNA oligo用经灭菌的去离子水配制成100μM。
        b. 如下设置退火反应体系：
        Nuclease-Free Water        70μl
        Oligo DNA annealing buffer（10×）        10μl
        DNA oligo A (100μM)        10μl
        DNA oligo B (100μM)        10μl
        Total        100μl
        按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。
        Oligo DNA annealing buffer (10×)：100mM Tris pH8.0, 500mM NaCl, 10mM EDTA

Place tube in a standard heatblock at 90–95 °C for 3–5 minutes. Remove the heat block from the apparatus and allow to cool to room temperature (or at least below 30 °C) on the workbench. Slow cooling to room temperature should take 45–60 minute
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借你一生好不好
11楼2013-12-22 13:01:24
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wxf-er

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zb0806030(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2013-12-19 09:18:24
合成的引物5'端应该没有磷酸化吧，如果没有，那就有两种处理：1，先磷酸化，然后退火成双链；2，先退火形成双链，然后5’端磷酸化。两种处理都行。如果，5‘端有磷酸化，那退火后直接连接。
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自然
3楼2013-12-18 22:40:10
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zb0806030: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-12-21 23:18:59
引用回帖:
4楼: Originally posted by zb0806030 at 2013-12-19 19:55:47
我的引物没有磷酸化，为什么要磷酸化，不磷酸化不行吗？
还有就是退火的时候怎么做，都需要加什么东西，怎么设置反应的参数？谢谢...

不需要进行任何磷酸化，但你载体酶切后绝对不能去磷酸化，否则就都没有磷酸基团了

退火，可用PCR仪，也可以直接放开水里面煮5min，然后放室温随水冷却到室温

[ Last edited by gyesang on 2013-12-22 at 01:25 ]
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5楼2013-12-19 20:46:05
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普通回帖

科技广场

铜虫 (小有名气)
好高深啊
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2楼2013-12-18 17:47:40
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wxf-er at 2013-12-18 22:40:10
合成的引物5'端应该没有磷酸化吧，如果没有，那就有两种处理：1，先磷酸化，然后退火成双链；2，先退火形成双链，然后5’端磷酸化。两种处理都行。如果，5‘端有磷酸化，那退火后直接连接。

我的引物没有磷酸化，为什么要磷酸化，不磷酸化不行吗？
还有就是退火的时候怎么做，都需要加什么东西，怎么设置反应的参数？谢谢
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厚积薄发
4楼2013-12-19 19:55:47
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wxf-er

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-19 20:46:05
不需要进行任何磷酸化，但你载体酶切后绝对不能去磷酸化，否则就都没有磷酸集团了

退火，可用PCR仪，也可以直接放开水里面煮5min，然后放室温随水冷却到室温...

合成的引物5‘端也是羟基，所以在连接的时候需要效率高的话，最好进行5’磷酸化；可以不作处理，直接连接。
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自然
6楼2013-12-20 11:01:10
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-19 20:46:05
不需要进行任何磷酸化，但你载体酶切后绝对不能去磷酸化，否则就都没有磷酸集团了

退火，可用PCR仪，也可以直接放开水里面煮5min，然后放室温随水冷却到室温...

那退火的时候只需要把两种引物1：1混合就行了吗？还要加什么缓冲液吗？谢谢！

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厚积薄发
7楼2013-12-21 23:21:08
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overhalfmoon

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-22 01:26:03
gyesang: 回帖置顶 2013-12-22 01:26:05
一般是加T4连接酶的buffer，然后引物等量混合。放到95度水浴锅，然后就可以关掉电源，让其缓慢降到室温就可以用来连进载体了

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8楼2013-12-21 23:25:01
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清雅风

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

这是一种新的技术，有专门的生物公司生产了专做这种连接的酶，国内好像还没有吧！都是直接买试剂的

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朝着自己的理想奔跑，就是幸福！
9楼2013-12-21 23:41:43
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 清雅风 at 2013-12-21 23:41:43
这是一种新的技术，有专门的生物公司生产了专做这种连接的酶，国内好像还没有吧！都是直接买试剂的

不需要特殊的连接酶，普通的T4 DNA连接酶就可以的，这样形成的连接产物两条链只有一条链连接，另外一条链为Nick
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10楼2013-12-22 01:27:21
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