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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 合成的引物直接退火形成粘性末端后连入载体
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zb0806030

银虫 (小有名气)

[求助] 合成的引物直接退火形成粘性末端后连入载体 已有5人参与

求助：有没有虫友做过合成两段互补的引物直接退火形成粘性末端以后再连入载体的？
请问具体的方法是怎样的呢？都需要加什么东西退火，反应应该怎么设置条件？
谢谢啦！
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厚积薄发
1楼 2013-12-18 16:47:27
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
zb0806030: 金币+4, ★★★★★最佳答案 2013-12-24 22:11:49
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:53:31
a. 把待退火的DNA oligo用经灭菌的去离子水配制成100μM。
        b. 如下设置退火反应体系：
        Nuclease-Free Water        70μl
        Oligo DNA annealing buffer（10×）        10μl
        DNA oligo A (100μM)        10μl
        DNA oligo B (100μM)        10μl
        Total        100μl
        按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。
        Oligo DNA annealing buffer (10×)：100mM Tris pH8.0, 500mM NaCl, 10mM EDTA

Place tube in a standard heatblock at 90–95 °C for 3–5 minutes. Remove the heat block from the apparatus and allow to cool to room temperature (or at least below 30 °C) on the workbench. Slow cooling to room temperature should take 45–60 minute
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借你一生好不好
11楼2013-12-22 13:01:24
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wxf-er

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zb0806030(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2013-12-19 09:18:24
合成的引物5'端应该没有磷酸化吧，如果没有，那就有两种处理：1，先磷酸化，然后退火成双链；2，先退火形成双链，然后5’端磷酸化。两种处理都行。如果，5‘端有磷酸化，那退火后直接连接。
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自然
3楼2013-12-18 22:40:10
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wxf-er at 2013-12-18 22:40:10
合成的引物5'端应该没有磷酸化吧，如果没有，那就有两种处理：1，先磷酸化，然后退火成双链；2，先退火形成双链，然后5’端磷酸化。两种处理都行。如果，5‘端有磷酸化，那退火后直接连接。

我的引物没有磷酸化，为什么要磷酸化，不磷酸化不行吗？
还有就是退火的时候怎么做，都需要加什么东西，怎么设置反应的参数？谢谢
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厚积薄发
4楼2013-12-19 19:55:47
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zb0806030: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-12-21 23:18:59
引用回帖:
4楼: Originally posted by zb0806030 at 2013-12-19 19:55:47
我的引物没有磷酸化，为什么要磷酸化，不磷酸化不行吗？
还有就是退火的时候怎么做，都需要加什么东西，怎么设置反应的参数？谢谢...

不需要进行任何磷酸化，但你载体酶切后绝对不能去磷酸化，否则就都没有磷酸基团了

退火，可用PCR仪，也可以直接放开水里面煮5min，然后放室温随水冷却到室温

[ Last edited by gyesang on 2013-12-22 at 01:25 ]
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2013-12-19 20:46:05
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