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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 合成的引物直接退火形成粘性末端后连入载体
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
zb0806030: 金币+4, ★★★★★最佳答案 2013-12-24 22:11:49
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:53:31
a. 把待退火的DNA oligo用经灭菌的去离子水配制成100μM。
        b. 如下设置退火反应体系：
        Nuclease-Free Water        70μl
        Oligo DNA annealing buffer（10×）        10μl
        DNA oligo A (100μM)        10μl
        DNA oligo B (100μM)        10μl
        Total        100μl
        按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。
        Oligo DNA annealing buffer (10×)：100mM Tris pH8.0, 500mM NaCl, 10mM EDTA

Place tube in a standard heatblock at 90–95 °C for 3–5 minutes. Remove the heat block from the apparatus and allow to cool to room temperature (or at least below 30 °C) on the workbench. Slow cooling to room temperature should take 45–60 minute
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借你一生好不好
11楼2013-12-22 13:01:24
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mosquito419

新虫 (初入文坛)
今天看到这个帖子。我的实验也是合成两个引物（50多bp),退火后形成双链（跑胶看过，大小都对），然后插入切好的质粒（质粒双酶切后，跑胶回收）。但是试了好几回，都连不起来，转化完全没有克隆长。不知是什么问题呢？
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12楼2015-07-26 09:13:58
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mosquito419

新虫 (初入文坛)
我的两条引物合成以后，没有进行磷酸化，是不是磷酸化必须的呢？我用的是takara的T4连接酶，室温1h, 2h或者16度过夜都连接不上
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13楼2015-07-26 09:16:20
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shenyouqishi

铁虫 (初入文坛)
我是第一次尝试退火连接，尝试了几种退火方式和反应体系都不行，请问，哪位大神能给一份成功率较高的反应体系和退火方式？我的引物带有酶切后的酶切位点。谢谢
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14楼2016-01-09 14:41:20
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