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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCDNA3.1+的抗性测序
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] PCDNA3.1+的抗性测序

前段时间用老板从国外实验室带的PCDNA做重组质粒，经过一系列酶切，连接，测序，终于做到转染CHO细胞准备过表达，在筛选稳定表达的细胞上出现了问题，一开始用G418筛选，细胞生长状态不好，细胞不是透明的梭形，而是黑色的，后来老板说他可能搞错了，是潮霉素抗性，又做了潮霉素，细胞还是这样，现在老板让我在PCDNA抗性前设置引物，拿去测序，然后去查这个抗性到底是什么，在做稳转之前做了一个瞬转，我现在的问题是不知道如何在PCDNA的抗性前设置引物，有没有哪位大侠指导下，或者说有别的更好的方法？
PS：在做稳转前我做了预实验瞬转，做了细胞免疫荧光，虽然转染效率不高，但是也能看到有的细胞转进去，应该可以排除质粒的问题，转染试剂的问题（虽然说转染试剂已经过期了。。其实老板让我们用的血清也是过期的。但是看细胞生长的还可以。），用潮霉素或者G418筛选的细胞大概1个月这样，发现细胞开始停止死亡，但是没有形成单个细胞群，而且细胞都是黑色的，用胰酶根本消化不下来，贴在皿上，求大侠分析。
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1楼 2013-12-15 00:07:41
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shisishese

银虫 (小有名气)
我也在做PCDNA3.1重组质粒转染CHO细胞，G418加压做稳定筛选，做了好几次都没筛选出来，后来发现转染的lipo2000过期了，以为是这个原因导致实验失败；后来就买了新的lipo2000，可还是筛选不出来，细胞经转染后死掉很多，而且与什么都不经处理的细胞比较，转染的细胞在形态上与它无差异。G418加压后，CHO细胞形态是圆形的，看不出有stable line， 真不晓得问题出在哪里
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2楼2014-12-04 20:51:02
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shisishese at 2014-12-04 20:51:02
我也在做PCDNA3.1重组质粒转染CHO细胞，G418加压做稳定筛选，做了好几次都没筛选出来，后来发现转染的lipo2000过期了，以为是这个原因导致实验失败；后来就买了新的lipo2000，可还是筛选不出来，细胞经转染后死掉很 ...

哎 我也是 现在换了罗氏的转染试剂 还是不行 你有条件的话用流式细胞仪吧 我是质粒上没装GFP 不能用
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3楼2014-12-05 17:35:48
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