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lipanxy2

新虫 (初入文坛)

[求助] 293细胞真核表达,最终表达在什么地方

细菌粘附素重组质粒在293细胞中表达,载体为pcDNA3。最终蛋白会表达在哪里?
我用的是cell lysis buffer裂解细胞,离心取上清。然后western blot检测,但是始终检测不到特异表达。
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zhouxiaofei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-31 20:14:56
如果平行实验蛋白提取方法没有问题,怀疑你的序列问题,是否测序正确。。还要这个蛋白是分泌蛋白么?会在胞外丰度比较高么?
6楼2013-10-31 17:12:29
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lipanxy2(kx444555代发): 金币+3, 鼓励交流 2013-10-31 13:28:19
这个蛋白表达出来很有可能在细胞的胞浆里面,你用WB检测不到特异表达,有几种情况:
1. 你的抗体不灵,压不出来条带,是否有阳性对照?可以克隆一个带tag的表达载体,比如在蛋白N或者C端fusion一个flag, HA 或者myc,His的tag,用tag抗体来检测

2. 蛋白根本没有表达,可能是克隆错误,基因移码突变了,或者表达载体有问题,检查下载体构建是否正确或者换个载体表达
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-10-30 22:42:09
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huoyongting

金虫 (正式写手)

楼主用的是239的哪种细胞呀
3楼2013-10-31 11:04:54
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lipanxy2

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-10-30 22:42:09
这个蛋白表达出来很有可能在细胞的胞浆里面,你用WB检测不到特异表达,有几种情况:
1. 你的抗体不灵,压不出来条带,是否有阳性对照?可以克隆一个带tag的表达载体,比如在蛋白N或者C端fusion一个flag, HA 或者my ...

你好,我已经通过RT-PCR检测到有表达,有阳性对照,可以压出条带的。只是这个转染的没有特异性的条带。
4楼2013-10-31 15:16:17
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