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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有人不用试剂盒做出5’RACE吗？
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litterone123

新虫 (初入文坛)

[求助] 有人不用试剂盒做出5’RACE吗？ 已有3人参与

我最近在做5’RACE，前段时间看见有人介绍不用试剂盒也能做出5'RACE.就按他的说法来做。他的帖子上写的“在反转录的过程中加入5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'这个接头引物。在反转录之后这段序列就会位于整个mRNA反转录出来的cDNA的最前端。”我用这个引物做了反转录，然后用保守序列的引物对cDNA进行了扩增，确实得到了大小相符的目的片段，还心中窃喜觉得马上大功告成了。但后来又用特异引物来扩增5’端的时候出来的带却在100-250之间（我的目的带有1500左右）。降低了退火温度也不行。请问一下有没有人做过类似的实验？？？急求 。。。
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1楼 2013-10-20 22:48:34
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yujitianqing

铁虫 (正式写手)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-21 11:49:49
反转录是用随机引物比如Random 9 mers，得到cDNA；再用5’引物和3’特异性引物进行PCR得到5’端的的片段……
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2楼2013-10-21 11:33:04
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混沌声神

新虫 (初入文坛)
我也想知道。。。
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3楼2014-09-22 12:07:54
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Huobol

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

这个序列5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'是Clontech试剂盒里的SMARTer II A Oligonucleotide，以前看过一个帖子说后面的3个GGG要磷酸化的啊，不知楼主是怎样合成的这个序列。
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让羽毛再飞一会儿
4楼2015-09-15 09:15:36
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

那个接头不是随便哪家公司都可以合成的，修饰过的

发自小木虫Android客户端
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5楼2015-09-15 10:04:18
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zljuile0713

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主问一下，这个接头是用普通的反转录试剂盒就能实现吗，比如takara的反转录试剂盒？还是需要别的酶
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6楼2015-10-07 11:17:28
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引路者

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zljuile0713 at 2015-10-07 11:17:28
楼主问一下，这个接头是用普通的反转录试剂盒就能实现吗，比如takara的反转录试剂盒？还是需要别的酶

如果用那种接头的话这个酶必须是M-MLV体系的反转录酶，核心技术是在第一链cDNA的3‘端加上三个C。所以试剂盒给的接头引物的末端的3个G就是用来识别的。
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我的学习就是我对这个世界的歌颂，我的研究就是我对这个世界的敬仰
7楼2015-10-07 19:37:50
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zljuile0713

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 引路者 at 2015-10-07 19:37:50
如果用那种接头的话这个酶必须是M-MLV体系的反转录酶，核心技术是在第一链cDNA的3‘端加上三个C。所以试剂盒给的接头引物的末端的3个G就是用来识别的。...

哦哦，原来如此，太感谢了！
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8楼2015-10-08 18:35:54
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0阿狸控0

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
9楼2019-08-23 16:50:40
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