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PCR引物设计 已有5人参与
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大家好， 我现在在做PCR ，设计了一对引物。刚开始的时候，结果很好，大小以及测序都是正确的。但是最近几次却出现跑胶弥散的现象，没有目的条带。我用的是cDNA作为模板，我用同样的模板、酶、buffer做内参基因以及其他的基因都很好，就是我现在的这一基因，我快急死了，请高手帮帮我！！！ 上游引物：5' CCA AGA CTC TGT ATG GAG TG 3' 下游引物：5' GGT CAC TGG AAG ATA TGG C 3' mRNA序列： 1 tgtgctgtgt gtcagagtgg attggagttg aaaaagcttg actggcgtca ttcgggagct 61 ggatggcttg ggacatgtgc agccaagact ctgtatggag tgacatagag tgtgctgctc 121 tggttggtga ggaccagcct ctttgcccag atcttcctga acttgacctt tctgaacttg 181 atgtgaatga cttggataca gacagctttc tgggtggatt gaagtggtgt agcgaccaat 241 cggaaatcat atccaaccag tacaacaatg agcctgcgaa catatttgag aagatagatg 301 aagagaatga ggcaaacttg ctagcggtcc tcacagagac actggacagt ctccccgtgg 361 atgaagacgg attgccctca tttgatgcac tgacagatgg agccgtgacc actgacaacg 421 aggccagtcc ttcctccatg cctgacggca cccctccccc tcaggaggca gaagagccgt 481 ctctacttaa gaagctctta ctggcaccag ccaacactca gctcagctac aatgaatgca 541 gcggtcttag cactcagaac catgcagcaa accacaccca caggatcaga acaaaccctg 601 ccattgttaa gaccgagaat tcatggagca ataaagcgaa gagcatttgt caacagcaaa 661 agccacaaag acgtccctgc tcagagcttc tcaagtatct gaccacaaac gatgaccctc 721 ctcacaccaa acccacagaa aacaggaaca gcagcagaga caaatgtgct tccaaaaaga 781 agtcccatac acaaccgcag tcgcaacatg ctcaagccaa accaacaact ttatctcttc 841 ctctgacccc agagtcacca aatttgtttt tataaatgtg ccatatcttc cagtgacccc 901 aagggttccc catttgagaa caagactatt gagcgaacct taagtgtgga actctctgga 961 actgcaggcc taactcctcc cacaactcct cctcataaag ccaaccaaga taaccctttc 1021 aaggcttcgc caaagctgaa gccctcttgc aagaccgtgg tgccaccgcc aaccaagagg 1081 gcccggtaca gtgagtgttc tggtacccaa ggcagccact ccaccaagaa agggcccgag 1141 caatctgagt tgtacgcaca actcagcaag tcctcagggc tcagccgagg acacgaggaa 1201 aggaagacta aacggcccag tctccggctg tttggtgacc atgactactg tcagtcactc 1261 aattccaaaa cggatatact cattaacata tcacaggagc tccaagactc tagacaacta 1321 gacttcaaag atgcctcctg tgactggcag gggcacatct gttcttccac agattcaggc 1381 cagtgctacc tgagagagac tttggaggcc agcaagcagg tctctccttg cagcaccaga 1441 aaacagctcc aagaccagga aatccgagcg gagctgaaca agcacttcgg tcatccctgt 1501 caagctgtgt ttgacgacaa atcagacaag accagtgaac taagggatgg cgacttcagt 1561 aatgaacaat tctccaaact acctgtgttt ataaattcag gactagccat ggatggccta 1621 tttgatgaca gtgaagatga aagtgataaa ctgagctacc cttgggatgg cacgcagccc 1681 tattcattgt tcgatgtgtc gccttcttgc tcttccttta actctccgtg tcgagactca 1741 gtgtcaccac cgaaatcctt attttctcaa agaccccaaa ggatgcgctc tcgttcaaga 1801 tccttttctc gacacaggtc gtgttcccga tcaccatatt ccaggtcaag atcaaggtcc 1861 ccaggcagta gatcctcttc aagatcctgt tactactatg aatcaagcca ctacagacac 1921 cgcacacacc gcaattctcc cttgtatgtg agatcacgtt caaggtcacc ctacagccgt 1981 aggcccaggt acgacagcta tgaagcctat gagcacgaaa ggctcaagag ggatgaatac 2041 cgcaaagagc acgagaagcg ggagtctgaa agggccaaac agagagagag gcagaagcag 2101 aaagcaattg aagagcgccg tgtgatttac gttggtaaaa tcagacctga cacaacgcgg 2161 acagaattga gagaccgctt tgaagttttt ggtgaaattg aggaatgcac cgtaaatctg 2221 cgggatgatg gagacagcta tggtttcatc acctaccgtt acacctgtga cgctttcgct 2281 gctcttgaga atggatatac tttacgcagg tcgaacgaaa ctgacttcga gctgtacttt 2341 tgtggacgga agcaattttt caagtctaac tatgcagacc tagataccaa ctcagacgat 2401 tttgaccctg cttccaccaa gagcaagtat gactctctgg attttgatag tttactgaag 2461 gaagctcaga gaagcttgcg caggtaacgt gttcccaggc tgaggaatga cagagagatg 2521 gtcaatacct catgggacag cgtgtccttt cccaagactc ttgcaagtca tacttaggaa 2581 tttctcctac tttacactct ctgtacaaaa ataaaacaaa acaaaacaac aataacaaca 2641 acaacaacaa caataacaac aacaaccata ccagaacaag aacaa |
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lmcyjxs
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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你好，我知道是目的基因，目的基因也需要引物吧？每个基因扩出来都是需要引物的，我也不确定是不是你的引物给污染了。你设计的引物我没有去用PP5检查，既然你之前扩出来过，大小也一致，一般来说设计方面就不会有问题，这点你要相信自己！一般来说，Oligo给出的引物退火温度比较合适，我自己的话，往往是引物合成公司提供的退火温度-5℃，一般都会P出来的，哪怕有非特异条带，也不会像你的那样。 本人不才，所学甚少，建议你好好检查下自己的各个步骤是否没有问题，包括试剂，琼脂糖胶的质量、配制甚至仪器是否有问题等等。其次好好回想总结，为是么之前就P出来了？为什么现在就不行？总是有环节出现问题才可能有不同的结果。另外，你的模板量加大点试试，其实你的梯度PCR可以看到条带，就是很暗，背景杂质多。最后，不知道你的后续试验用来干嘛，要求不高的话，可先做下去试试，不要在这个地方浪费很多时间 本人罗嗦，不才，望见谅，祝好 |
10楼2013-10-09 14:05:40
lmcyjxs
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4楼2013-10-09 09:34:27