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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 虐心的PCR-DGGE
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doubleping

新虫 (小有名气)

[求助] 虐心的PCR-DGGE

实验做得我快绝望了！！！！
我是做土壤微生物群落，先提取了土壤中的DNA，呈黄棕色，经过稀释不同倍数之后扩增出了16S，然后扩增了V3区，但是有非特异性条带，接着用V3产物去跑DGGE，62℃，20V，10min预跑，然后是62℃，7H，120V，一直在调试最好的梯度，刚调试到梯度47%-62%的时候，感觉条带还是有点靠下面，想再试试50%-60%。。。。。。可是悲剧就来了，竟然一条条带都没有跑出来，或者有时候有一块胶有条带有一块没有条带，（我用的是缓冲液7L的bio-rad的DGGE，可以同时跑两块胶）但是我点的DL2000都有跑出来，真让我郁闷！！！我以为是样品问题，但是同样的样品检测有亮带，还有一次竟然同样的样品第二次DGGE有条带还很多。
想重新扩增样品，可是这两天本来可以全部扩增出来的样品现在16S竟然有一半扩不出来，16S产物全部扩不出V3区，想不出什么道理！
有16S可以扩出来，酶和16S引物应该是没有问题的，V3的引物是刚稀释的可能有问题，其他我就想不出来了，各位大侠帮我找找原因吧
我的体系，16S和V3区一样都是30ul，
2*taq mastermix   15ul
引物各              1ul
模板           1ul
ddH2O        12ul
16S程序：94℃   5min；94℃  1min，55℃   1min，72℃   2min；30循环；72℃  10min。
V3区程序：touchdown
DGGE胶：47%-62%
47%：100%变性剂  9.4ml+0%变性剂  10.6ml+80ul APS+10ul  TEMED
62%:100%变性剂  12.4ml+0%变性剂  7.6ml+80ul APS+10ul  TEMED
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核酸生物学实验经验 环境微生物 dgge

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1楼2013-09-21 23:30:29
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枫叶丹

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的目的片段是多大，你确定你的电压和跑的时间是对的吗
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2楼2013-09-22 07:57:45
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lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-22 11:51:42
首先你的DNA是不是有问题；
再来PCR引物是不是多了点，P不出来的原因太多，这个要你自己慢慢找原因了；
最后DGGE，感觉你做的比较乱，先说做胶，因为我们通常做的梯度大多不超过70%，所以你可以配一个70%和0%的变性剂，再来配相应的梯度，这样可使控制一下误差，不然每次做胶的梯度误差太大；还有梯度不需要这么精确，差不多就可以。电泳的时间和电压你可以参照别人的先跑，再自己调整，刚开始电压大一点，我都是先200V，5min之后再接着跑的。
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3楼2013-09-22 08:54:20
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 枫叶丹 at 2013-09-22 07:57:45
你的目的片段是多大，你确定你的电压和跑的时间是对的吗

目的片段是250bp左右，电压和时间是之前摸索出来可以跑出来的
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4楼2013-09-22 09:42:02
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lhf903 at 2013-09-22 08:54:20
首先你的DNA是不是有问题；
再来PCR引物是不是多了点，P不出来的原因太多，这个要你自己慢慢找原因了；
最后DGGE，感觉你做的比较乱，先说做胶，因为我们通常做的梯度大多不超过70%，所以你可以配一个70%和0%的变 ...

DNA我也怀疑有问题就是不知道什么问题怎么办
引物多了是什么意思？
我每次做胶的时候都是从针筒的同一位置灌胶的，应该误差不会大
电压和时间是之前有跑出来，条带比较好的
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5楼2013-09-22 09:45:02
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-22 11:51:48
试试不用touchdown PCR呢？就用最简单的经典三段式PCR程序，我以前做PCR-DGGE都是这样扩增的。
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6楼2013-09-22 10:38:51
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电魂

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以用GC buffer体系试试，只要不是模版降解，应该能扩出来。
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7楼2013-09-22 21:29:59
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 电魂 at 2013-09-22 21:29:59
你可以用GC buffer体系试试，只要不是模版降解，应该能扩出来。

GC buffer体系是指样品含有GC夹吗？我的引物是含有GC夹的
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8楼2013-09-22 21:39:30
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
P楼主的情况可能是：PCR扩增后目的带未出现而出现非特异性扩增带

2013年9月5日

PCR扩增后目的带未出现而出现非特异性扩增带，其原因与对策如下：一．引物的特异性差，受非特异性的PCR扩增的竞争性抑制作用的影响，靶基因的PCR扩增效率低，特异性的PCR产物极少。可能的具体原因和对策如下：
设立阳性和阴性对照，检查反应体系是否被污染。如果被污染则采用相应的对策消除污染。具体见“二”。
加强DNA聚合酶的专一性。
3.Taq DNA聚合酶的专一性扩增不够。改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。    酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
    在反应体系中加入：1.0mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以稳定 DNA聚合酶。
3.缩短退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。
4.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。
　　使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
　　使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。

二．反应体系被污染：这种污染有两种原因：
1.整个基因组或大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。这种非特异性带出现可用以下方法解决：（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（4）重新提取模板DNA。2.空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间，还可用巢式PCR方法来减轻或消除空气中的小片段核酸造成的污染，最基本的解决办法：重新提取模板DNA。

　　前面所有措施都不行，那就只好重新设引物了。本文是2013年9月5日早晨我刚刚重新写的。
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9楼2013-09-22 22:09:06
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

另外请楼主按照：John M.S.Bartlett and David Stirling, PCR Protocols(second Edition)-MMB-226.
仔细对照一下你的实验设计。

John M.S.Bartlett and David Stirling, PCR Protocols(second Edition)-MMB-226.
下载处：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6385666
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10楼2013-09-22 22:11:31
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