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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 虐心的PCR-DGGE
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doubleping

新虫 (小有名气)

[求助] 虐心的PCR-DGGE

实验做得我快绝望了！！！！
我是做土壤微生物群落，先提取了土壤中的DNA，呈黄棕色，经过稀释不同倍数之后扩增出了16S，然后扩增了V3区，但是有非特异性条带，接着用V3产物去跑DGGE，62℃，20V，10min预跑，然后是62℃，7H，120V，一直在调试最好的梯度，刚调试到梯度47%-62%的时候，感觉条带还是有点靠下面，想再试试50%-60%。。。。。。可是悲剧就来了，竟然一条条带都没有跑出来，或者有时候有一块胶有条带有一块没有条带，（我用的是缓冲液7L的bio-rad的DGGE，可以同时跑两块胶）但是我点的DL2000都有跑出来，真让我郁闷！！！我以为是样品问题，但是同样的样品检测有亮带，还有一次竟然同样的样品第二次DGGE有条带还很多。
想重新扩增样品，可是这两天本来可以全部扩增出来的样品现在16S竟然有一半扩不出来，16S产物全部扩不出V3区，想不出什么道理！
有16S可以扩出来，酶和16S引物应该是没有问题的，V3的引物是刚稀释的可能有问题，其他我就想不出来了，各位大侠帮我找找原因吧
我的体系，16S和V3区一样都是30ul，
2*taq mastermix   15ul
引物各              1ul
模板           1ul
ddH2O        12ul
16S程序：94℃   5min；94℃  1min，55℃   1min，72℃   2min；30循环；72℃  10min。
V3区程序：touchdown
DGGE胶：47%-62%
47%：100%变性剂  9.4ml+0%变性剂  10.6ml+80ul APS+10ul  TEMED
62%:100%变性剂  12.4ml+0%变性剂  7.6ml+80ul APS+10ul  TEMED
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1楼2013-09-21 23:30:29
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lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-22 11:51:42
首先你的DNA是不是有问题；
再来PCR引物是不是多了点，P不出来的原因太多，这个要你自己慢慢找原因了；
最后DGGE，感觉你做的比较乱，先说做胶，因为我们通常做的梯度大多不超过70%，所以你可以配一个70%和0%的变性剂，再来配相应的梯度，这样可使控制一下误差，不然每次做胶的梯度误差太大；还有梯度不需要这么精确，差不多就可以。电泳的时间和电压你可以参照别人的先跑，再自己调整，刚开始电压大一点，我都是先200V，5min之后再接着跑的。
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3楼2013-09-22 08:54:20
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枫叶丹

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的目的片段是多大，你确定你的电压和跑的时间是对的吗
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2楼2013-09-22 07:57:45
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 枫叶丹 at 2013-09-22 07:57:45
你的目的片段是多大，你确定你的电压和跑的时间是对的吗

目的片段是250bp左右，电压和时间是之前摸索出来可以跑出来的
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4楼2013-09-22 09:42:02
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doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lhf903 at 2013-09-22 08:54:20
首先你的DNA是不是有问题；
再来PCR引物是不是多了点，P不出来的原因太多，这个要你自己慢慢找原因了；
最后DGGE，感觉你做的比较乱，先说做胶，因为我们通常做的梯度大多不超过70%，所以你可以配一个70%和0%的变 ...

DNA我也怀疑有问题就是不知道什么问题怎么办
引物多了是什么意思？
我每次做胶的时候都是从针筒的同一位置灌胶的，应该误差不会大
电压和时间是之前有跑出来，条带比较好的
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5楼2013-09-22 09:45:02
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