应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 虐心的PCR-DGGE
51/1返回列表
查看: 2734  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

doubleping

新虫 (小有名气)

[求助] 虐心的PCR-DGGE

实验做得我快绝望了！！！！
我是做土壤微生物群落，先提取了土壤中的DNA，呈黄棕色，经过稀释不同倍数之后扩增出了16S，然后扩增了V3区，但是有非特异性条带，接着用V3产物去跑DGGE，62℃，20V，10min预跑，然后是62℃，7H，120V，一直在调试最好的梯度，刚调试到梯度47%-62%的时候，感觉条带还是有点靠下面，想再试试50%-60%。。。。。。可是悲剧就来了，竟然一条条带都没有跑出来，或者有时候有一块胶有条带有一块没有条带，（我用的是缓冲液7L的bio-rad的DGGE，可以同时跑两块胶）但是我点的DL2000都有跑出来，真让我郁闷！！！我以为是样品问题，但是同样的样品检测有亮带，还有一次竟然同样的样品第二次DGGE有条带还很多。
想重新扩增样品，可是这两天本来可以全部扩增出来的样品现在16S竟然有一半扩不出来，16S产物全部扩不出V3区，想不出什么道理！
有16S可以扩出来，酶和16S引物应该是没有问题的，V3的引物是刚稀释的可能有问题，其他我就想不出来了，各位大侠帮我找找原因吧
我的体系，16S和V3区一样都是30ul，
2*taq mastermix   15ul
引物各              1ul
模板           1ul
ddH2O        12ul
16S程序：94℃   5min；94℃  1min，55℃   1min，72℃   2min；30循环；72℃  10min。
V3区程序：touchdown
DGGE胶：47%-62%
47%：100%变性剂  9.4ml+0%变性剂  10.6ml+80ul APS+10ul  TEMED
62%:100%变性剂  12.4ml+0%变性剂  7.6ml+80ul APS+10ul  TEMED
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验 环境微生物 dgge

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-09-21 23:30:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 枫叶丹 at 2013-09-22 07:57:45
你的目的片段是多大，你确定你的电压和跑的时间是对的吗

目的片段是250bp左右，电压和时间是之前摸索出来可以跑出来的
赞一下 回复此楼
4楼2013-09-22 09:42:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

枫叶丹

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的目的片段是多大，你确定你的电压和跑的时间是对的吗
赞一下 回复此楼
2楼2013-09-22 07:57:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-09-22 11:51:42
首先你的DNA是不是有问题；
再来PCR引物是不是多了点，P不出来的原因太多，这个要你自己慢慢找原因了；
最后DGGE，感觉你做的比较乱，先说做胶，因为我们通常做的梯度大多不超过70%，所以你可以配一个70%和0%的变性剂，再来配相应的梯度，这样可使控制一下误差，不然每次做胶的梯度误差太大；还有梯度不需要这么精确，差不多就可以。电泳的时间和电压你可以参照别人的先跑，再自己调整，刚开始电压大一点，我都是先200V，5min之后再接着跑的。
赞一下 回复此楼
3楼2013-09-22 08:54:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

doubleping

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lhf903 at 2013-09-22 08:54:20
首先你的DNA是不是有问题；
再来PCR引物是不是多了点，P不出来的原因太多，这个要你自己慢慢找原因了；
最后DGGE，感觉你做的比较乱，先说做胶，因为我们通常做的梯度大多不超过70%，所以你可以配一个70%和0%的变 ...

DNA我也怀疑有问题就是不知道什么问题怎么办
引物多了是什么意思？
我每次做胶的时候都是从针筒的同一位置灌胶的，应该误差不会大
电压和时间是之前有跑出来，条带比较好的
赞一下 回复此楼
5楼2013-09-22 09:45:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[文学芳草园] 梦想 +5 myrtle 2026-08-26 7/350 2026-09-01 15:18 by myrtle
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +6 叶九微 2026-08-26 6/300 2026-08-31 23:54 by yudaoqian88
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +17 爱看书的可乐 2026-08-26 19/950 2026-08-31 21:30 by xiangy672
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +6 zhaosm1982 2026-08-27 7/350 2026-08-31 21:18 by qdxxmc
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +6 yuleib84 2026-08-26 7/350 2026-08-31 19:46 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 面上意见出来了 +12 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 23/1150 2026-08-31 18:57 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 基金不中，共勉 +12 eulota 2026-08-26 12/600 2026-08-31 08:42 by ZJTJZ
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭