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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)

[求助] 连接老连不上,求指导

最近,本来挺简单的连接老出问题,自己也试了很多次。
实验目标:将一个载体上启动子替换成另外的启动子,用的酶切位点是DraIII,扩增所需启动子的引物上有该酶切位点,还加上保护碱基GGG,上游引物为5'GGGCACGGGGTGAGGGAACAAAAGCTGGGTAC3' ;下游为5'GGGCACTTTGTGAATCCATGCTAGAGTCCC3',扩增后酶切回收,再与相应的载体连接;连接体系载体和产物的浓度都很高,之前也试过很多体系,都不行,求指导!
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zhouking8758

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-09 15:10:14
建议先上T载体,再酶切克隆。
另外,可以多增加几个保护碱基。
4楼2013-09-08 23:24:38
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查看全部 12 个回答

mochenmi

铜虫 (小有名气)

为什么我没有看见酶切位点?  还有你酶切后回收到片段了?
2楼2013-09-08 21:47:57
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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mochenmi at 2013-09-08 21:47:57
为什么我没有看见酶切位点?  还有你酶切后回收到片段了?

CACNNNGTG是酶切位点,回收片段为900bp
3楼2013-09-08 22:05:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-09 15:10:20
因为DraIII切出2'突出的NNN粘性末端,你确定载体上的DraIII位点上的NNN也是GGG?不是的话,粘性末端不匹配,需要做成平末端后连接。
5楼2013-09-09 00:01:12
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