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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接老连不上，求指导
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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)

[求助] 连接老连不上，求指导

最近，本来挺简单的连接老出问题，自己也试了很多次。
实验目标：将一个载体上启动子替换成另外的启动子，用的酶切位点是DraIII,扩增所需启动子的引物上有该酶切位点，还加上保护碱基GGG,上游引物为5'GGGCACGGGGTGAGGGAACAAAAGCTGGGTAC3' ；下游为5'GGGCACTTTGTGAATCCATGCTAGAGTCCC3'，扩增后酶切回收，再与相应的载体连接；连接体系载体和产物的浓度都很高，之前也试过很多体系，都不行，求指导！
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1楼2013-09-08 19:55:06
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lliu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
紫眸玉儿: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-09-16 10:09:25
内容已删除
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11楼2013-09-10 01:21:34
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普通回帖

mochenmi

铜虫 (小有名气)
为什么我没有看见酶切位点？  还有你酶切后回收到片段了？
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2楼2013-09-08 21:47:57
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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mochenmi at 2013-09-08 21:47:57
为什么我没有看见酶切位点？  还有你酶切后回收到片段了？

CACNNNGTG是酶切位点，回收片段为900bp
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3楼2013-09-08 22:05:24
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zhouking8758

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-09 15:10:14
建议先上T载体，再酶切克隆。
另外，可以多增加几个保护碱基。
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4楼2013-09-08 23:24:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-09 15:10:20
因为DraIII切出2'突出的NNN粘性末端，你确定载体上的DraIII位点上的NNN也是GGG？不是的话，粘性末端不匹配，需要做成平末端后连接。
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5楼2013-09-09 00:01:12
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是保护碱基太少的问题，先连接T载体或平端连接再酶切看看。
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为什么
6楼2013-09-09 09:48:07
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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhouking8758 at 2013-09-08 23:24:38
建议先上T载体，再酶切克隆。
另外，可以多增加几个保护碱基。

谢谢
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7楼2013-09-09 14:15:32
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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-09 00:01:12
因为DraIII切出2'突出的NNN粘性末端，你确定载体上的DraIII位点上的NNN也是GGG？不是的话，粘性末端不匹配，需要做成平末端后连接。

一个是GGG,另一端是TTT,所以引物设计用的也是这两个位点
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8楼2013-09-09 14:16:52
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紫眸玉儿

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 547star at 2013-09-09 09:48:07
可能是保护碱基太少的问题，先连接T载体或平端连接再酶切看看。

谢谢，我先试试吧！
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9楼2013-09-09 14:17:27
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冰风颤木

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
曾今也遇到该问题，现在没有出现过了啊 我的方法是：
（1）把片段先做T克隆 然后测序 如果正确再做链接；
（2）感受态制作很重要 这个很重要 一定要全程冰浴
你再试试吧 应该没有问题的
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船到桥头自然直
10楼2013-09-09 18:00:21
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