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TA克隆求助
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本人前面做TA克隆，将PCR产物（1000bp多点）切胶回收后连接pMD19-T simple载体（体系：载体1uL，PCR产物4uL，Solution I 5uL），16 ℃连接1h（说明书要求30min），先后转化DH5α感受态（鼎国）和Top10（天根），涂氨苄平板，都不长菌落。 请各位虫友帮忙分析一下，感激不尽！ |
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gyesang: 回帖置顶 2013-08-26 18:34:53
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楼主你好 曾经我也遇到这样的问题 现在基本上不会了 我的解决办法如下： 1、你的连接体系没有问题 我的大小也是和你的差不多大 也是这么连接的，我不是16℃连接1小时，你可以试试4℃过夜连接试试，我比较过二者的差异性，后者的效果很好，我一开始是16℃连接长的不多或者很少，但是改用4℃过夜连接，每次都会长出来，且转化子很多； 2、你的感受态很可能有问题，你可以自己试试做下感受态，感受态在制作和使用的过程中必须要全程冰浴，如果你没有全程冰浴，很可能转化效率就会很低，基本上没有转化子。 最后你试试吧，如果还有问题 可以联系我啊 希望你顺利解决问题! |
11楼2013-08-26 14:26:31
yujitianqing
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14楼2013-08-26 18:55:20
guxinhan123
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2楼2013-08-25 21:11:05
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cicelyzh
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4楼2013-08-25 23:21:55
yujitianqing
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5楼2013-08-26 09:02:01
jacky1985310
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sxxuan
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前面的虫友都讲了pcr产物加A和质量之类的问题了 我曾经比较过，pMD18-T连接30min或1h的效率其实是比较低的，估计这个pMD19可能也是差不多。如果可以的话，连接过夜，或者22℃连接2h，效果会好很多。 其实如果在PCR产物正常加A，产物质量也高，感受态也好，转化步骤也正常的情况下，就算连接不彻底，转化也不会有太大问题。但问题就是你得确保上述都很好。 |
7楼2013-08-26 11:14:07
8楼2013-08-26 14:14:03
9楼2013-08-26 14:14:35
10楼2013-08-26 14:15:45