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M110935

金虫 (小有名气)

应助: 3 (幼儿园)
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在线: 27.8小时
虫号: 1949727
注册: 2012-08-21
性别: GG
专业: 动物遗传学

[求助] TA克隆求助

本人前面做TA克隆，将PCR产物（1000bp多点）切胶回收后连接pMD19-T simple载体（体系：载体1uL，PCR产物4uL，Solution I 5uL），16 ℃连接1h（说明书要求30min），先后转化DH5α感受态（鼎国）和Top10（天根），涂氨苄平板，都不长菌落。
请各位虫友帮忙分析一下，感激不尽！

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1楼 2013-08-25 19:39:22

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

yujitianqing

铁虫 (正式写手)

应助: 19 (小学生)
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帖子: 415
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虫号: 1948377
注册: 2012-08-20
专业: 生物大分子结构与功能

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:28:23

引用回帖:

8楼: Originally posted by M110935 at 2013-08-26 14:14:03
载体与产物1:4（要求1:2-10），转化步骤我应该能保证没有问题，因为TA克隆我曾经做过，没出什么问题。不过转化是恢复抗性用的是LB培养基，不知道有没有影响，SOC我们这都没听过。还有，怎么判断PCR产物末端是否有游 ...

SOC培养基营养更为丰富，可用于转化前的恢复培养。SOC具体配方可以百度下。
有无A与所用的DNA聚合酶有关，Taq酶扩增的产物末端均携带游离的A，TA克隆是针对这一特点而开发的产品，而有些高保真酶末端是平端。做个对照组，一步步找找原因吧，1kb左右的插入片段做TA克隆不会很难。