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M110935

金虫 (小有名气)

[求助] TA克隆求助

本人前面做TA克隆，将PCR产物（1000bp多点）切胶回收后连接pMD19-T simple载体（体系：载体1uL，PCR产物4uL，Solution I 5uL），16 ℃连接1h（说明书要求30min），先后转化DH5α感受态（鼎国）和Top10（天根），涂氨苄平板，都不长菌落。
请各位虫友帮忙分析一下，感激不尽！
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分子生化实验经验积累

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1楼2013-08-25 19:39:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yujitianqing

铁虫 (正式写手)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:28:23
引用回帖:
8楼: Originally posted by M110935 at 2013-08-26 14:14:03
载体与产物1:4（要求1:2-10），转化步骤我应该能保证没有问题，因为TA克隆我曾经做过，没出什么问题。不过转化是恢复抗性用的是LB培养基，不知道有没有影响，SOC我们这都没听过。还有，怎么判断PCR产物末端是否有游 ...

SOC培养基营养更为丰富，可用于转化前的恢复培养。SOC具体配方可以百度下。
有无A与所用的DNA聚合酶有关，Taq酶扩增的产物末端均携带游离的A，TA克隆是针对这一特点而开发的产品，而有些高保真酶末端是平端。做个对照组，一步步找找原因吧，1kb左右的插入片段做TA克隆不会很难。
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14楼2013-08-26 18:55:20
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普通回帖

guxinhan123

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-25 22:38:45
M110935: 金币+1, ★有帮助, 载体是新买的，目前怀疑是感受态的问题，在重新做。谢谢 2013-08-26 14:09:16
换个新的载体或者重做感受态试下
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2楼2013-08-25 21:11:05
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子墨无极

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
回收产物浓度和纯度怎么样
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追求无止境
3楼2013-08-25 22:04:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助, 用rTaq酶，前面做的时候没设对照，后面会试试，谢谢。 2013-08-26 14:10:13
PCR是用的Taq酶吗？PCR产物回收后定量，按照浓度建立连接体系。此外，连接和转化是最好有正负对照。如果目标克隆什么都不长，硬参考正对照是否做出来。
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4楼2013-08-25 23:21:55
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yujitianqing

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-26 14:13:59
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 18:34:14
个人觉得购买的感受态、连接载体试剂盒不会有问题。
载体和PCR产物比例有没问题？
PCR产物末端是否有游离的A？
转化步骤是否有问题?经过热激吗？转化过程中加培养基恢复抗氨苄的培养基最好是SOC。
氨苄浓度做好不要太高，50ng/ml就可以了。
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5楼2013-08-26 09:02:01
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jacky1985310

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-26 14:14:11
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 18:34:21
请问你PCR时使用的是什么酶？如果是高保真的诸如PRIMESTAR的酶，那么在你产物的两端是没有加A的，高保真酶会将其切除。这种情况下你要再用taq酶72℃跑个5分钟，加上A后再进行连接就可以了。
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6楼2013-08-26 10:52:54
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-26 14:14:55
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-26 18:34:29
前面的虫友都讲了pcr产物加A和质量之类的问题了
我曾经比较过，pMD18-T连接30min或1h的效率其实是比较低的，估计这个pMD19可能也是差不多。如果可以的话，连接过夜，或者22℃连接2h，效果会好很多。
其实如果在PCR产物正常加A，产物质量也高，感受态也好，转化步骤也正常的情况下，就算连接不彻底，转化也不会有太大问题。但问题就是你得确保上述都很好。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
7楼2013-08-26 11:14:07
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M110935

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yujitianqing at 2013-08-26 09:02:01
个人觉得购买的感受态、连接载体试剂盒不会有问题。
载体和PCR产物比例有没问题？
PCR产物末端是否有游离的A？
转化步骤是否有问题?经过热激吗？转化过程中加培养基恢复抗氨苄的培养基最好是SOC。
氨苄浓度做好 ...

载体与产物1:4（要求1:2-10），转化步骤我应该能保证没有问题，因为TA克隆我曾经做过，没出什么问题。不过转化是恢复抗性用的是LB培养基，不知道有没有影响，SOC我们这都没听过。还有，怎么判断PCR产物末端是否有游离的A？谢谢
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8楼2013-08-26 14:14:03
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M110935

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jacky1985310 at 2013-08-26 10:52:54
请问你PCR时使用的是什么酶？如果是高保真的诸如PRIMESTAR的酶，那么在你产物的两端是没有加A的，高保真酶会将其切除。这种情况下你要再用taq酶72℃跑个5分钟，加上A后再进行连接就可以了。

用的rTaq酶，应该是没有什么问题的
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9楼2013-08-26 14:14:35
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M110935

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by sxxuan at 2013-08-26 11:14:07
前面的虫友都讲了pcr产物加A和质量之类的问题了
我曾经比较过，pMD18-T连接30min或1h的效率其实是比较低的，估计这个pMD19可能也是差不多。如果可以的话，连接过夜，或者22℃连接2h，效果会好很多。
其实如果在PC ...

第一次做，也是16℃连16h，后来看说明书只要30min，所以就改为连接1h，反正是都没做出来
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10楼2013-08-26 14:15:45
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