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M110935

金虫 (小有名气)

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专业: 动物遗传学

[求助] TA克隆求助

本人前面做TA克隆，将PCR产物（1000bp多点）切胶回收后连接pMD19-T simple载体（体系：载体1uL，PCR产物4uL，Solution I 5uL），16 ℃连接1h（说明书要求30min），先后转化DH5α感受态（鼎国）和Top10（天根），涂氨苄平板，都不长菌落。
请各位虫友帮忙分析一下，感激不尽！

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1楼2013-08-25 19:39:22

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sxxuan

金虫 (著名写手)

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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-26 14:14:55
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-26 18:34:29

前面的虫友都讲了pcr产物加A和质量之类的问题了
我曾经比较过，pMD18-T连接30min或1h的效率其实是比较低的，估计这个pMD19可能也是差不多。如果可以的话，连接过夜，或者22℃连接2h，效果会好很多。
其实如果在PCR产物正常加A，产物质量也高，感受态也好，转化步骤也正常的情况下，就算连接不彻底，转化也不会有太大问题。但问题就是你得确保上述都很好。