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M110935

金虫 (小有名气)

[求助] TA克隆求助

本人前面做TA克隆,将PCR产物(1000bp多点)切胶回收后连接pMD19-T simple载体(体系:载体1uL,PCR产物4uL,Solution I 5uL),16 ℃连接1h(说明书要求30min),先后转化DH5α感受态(鼎国)和Top10(天根),涂氨苄平板,都不长菌落。
请各位虫友帮忙分析一下,感激不尽!
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M110935

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by sxxuan at 2013-08-26 11:14:07
前面的虫友都讲了pcr产物加A和质量之类的问题了
我曾经比较过,pMD18-T连接30min或1h的效率其实是比较低的,估计这个pMD19可能也是差不多。如果可以的话,连接过夜,或者22℃连接2h,效果会好很多。
其实如果在PC ...

第一次做,也是16℃连16h,后来看说明书只要30min,所以就改为连接1h,反正是都没做出来
10楼2013-08-26 14:15:45
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guxinhan123

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-25 22:38:45
M110935: 金币+1, 有帮助, 载体是新买的,目前怀疑是感受态的问题,在重新做。谢谢 2013-08-26 14:09:16
换个新的载体或者重做感受态试下
2楼2013-08-25 21:11:05
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子墨无极

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
回收产物浓度和纯度怎么样
追求无止境
3楼2013-08-25 22:04:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助, 用rTaq酶,前面做的时候没设对照,后面会试试,谢谢。 2013-08-26 14:10:13
PCR是用的Taq酶吗?PCR产物回收后定量,按照浓度建立连接体系。此外,连接和转化是最好有正负对照。如果目标克隆什么都不长,硬参考正对照是否做出来。
4楼2013-08-25 23:21:55
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