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冰风颤木

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+3, ★★★很有帮助, 实在太感谢你了。今天我就按你说的去做 2013-08-26 14:34:44
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 18:34:51
gyesang: 回帖置顶 2013-08-26 18:34:53
楼主你好 曾经我也遇到这样的问题 现在基本上不会了
我的解决办法如下：
1、你的连接体系没有问题 我的大小也是和你的差不多大 也是这么连接的，我不是16℃连接1小时，你可以试试4℃过夜连接试试，我比较过二者的差异性，后者的效果很好，我一开始是16℃连接长的不多或者很少，但是改用4℃过夜连接，每次都会长出来，且转化子很多；
2、你的感受态很可能有问题，你可以自己试试做下感受态，感受态在制作和使用的过程中必须要全程冰浴，如果你没有全程冰浴，很可能转化效率就会很低，基本上没有转化子。
最后你试试吧，如果还有问题 可以联系我啊 希望你顺利解决问题!
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船到桥头自然直
11楼2013-08-26 14:26:31
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wang6rrtoy

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-26 18:34:59
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-26 18:39:13
在下也是用的pMD-19，因为我的目的片段至于250bp所以16度链接30min就好了   菌能长出来，但是比较奇葩的是没有蓝斑，但是菌液PCR能P出来，问过卖试剂盒的，他说能P出来就说明我的链接效率很高。你的1000bp的话估计得3h以上会好一点，还有就是确定下你的感受态细胞的浓度，如果浓度太低，而你涂平板时加的又少，很可能张不出来。
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好好学习
12楼2013-08-26 17:06:45
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M110935

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by wang6rrtoy at 2013-08-26 17:06:45
在下也是用的pMD-19，因为我的目的片段至于250bp所以16度链接30min就好了   菌能长出来，但是比较奇葩的是没有蓝斑，但是菌液PCR能P出来，问过卖试剂盒的，他说能P出来就说明我的链接效率很高。你的1000bp的话估计得 ...

谢谢回复。前一次我还特地离心去掉大部分培养基，然后重悬。每次涂板都用200uL
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13楼2013-08-26 18:39:57
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yujitianqing

铁虫 (正式写手)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:28:23
引用回帖:
8楼: Originally posted by M110935 at 2013-08-26 14:14:03
载体与产物1:4（要求1:2-10），转化步骤我应该能保证没有问题，因为TA克隆我曾经做过，没出什么问题。不过转化是恢复抗性用的是LB培养基，不知道有没有影响，SOC我们这都没听过。还有，怎么判断PCR产物末端是否有游 ...

SOC培养基营养更为丰富，可用于转化前的恢复培养。SOC具体配方可以百度下。
有无A与所用的DNA聚合酶有关，Taq酶扩增的产物末端均携带游离的A，TA克隆是针对这一特点而开发的产品，而有些高保真酶末端是平端。做个对照组，一步步找找原因吧，1kb左右的插入片段做TA克隆不会很难。
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14楼2013-08-26 18:55:20
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M110935

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by yujitianqing at 2013-08-26 18:55:20
SOC培养基营养更为丰富，可用于转化前的恢复培养。SOC具体配方可以百度下。
有无A与所用的DNA聚合酶有关，Taq酶扩增的产物末端均携带游离的A，TA克隆是针对这一特点而开发的产品，而有些高保真酶末端是平端。做个 ...

:hand感谢
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15楼2013-08-26 19:57:48
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weithermo

新虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-27 22:28:32
没有转化子刻有多种原因，因而尽量用阳性对照帮你查找原因。首先，就象有人建议的一样，要知道PCR所用的DNA聚合酶。并使其和链接载体匹配。Taq之类的每要连到TA克隆载体，而Phusion和Pfu不产生多余的A，是钝端连接。你可以试一下赛默飞世尔的CloneJET PCR 的克隆试剂盒，无论钝端和粘端都何以。5到10分钟室温处理后即可转化。此试剂盒的另个好处是生长的菌落99%都含有克隆·片段。建议每次转化都用很少量的质粒做阳性对照。
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16楼2013-08-27 03:27:49
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-27 15:15:58
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:28:37
建议：
1.设立其他质粒的阳性对照。实验室随便找个同抗性质粒，大倍数稀释（100倍至1000倍），作为对照。
2.感受态的阴性对照（无质粒）抗性平板不生长（防止抗生素失效引起的假阳性），还要用无抗性平板看热激后感受态细胞的存活情况
3.4℃连接过夜（PCR产物的比例可以提高，我一般都是1:10~1:20左右）效率低的话就4℃多放几天，我做过1周的，没事。
4.转化时的热激时间影响很大，我一般是45s。你可以参照2中的菌落数，调整。
5.转化时的晃动，尤其是剧烈的摇晃，跑步上下楼等。冰浴。扩增的转速不可过快（千万别放抗生素）
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17楼2013-08-27 09:11:34
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雙子の殇

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-08-27 22:28:45
1000bp应该是很好连的，我们用的PMD18-T，4℃过夜或者16℃都可以
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18楼2013-08-27 16:29:14
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