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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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M110935

金虫 (小有名气)

[求助] TA克隆求助

本人前面做TA克隆，将PCR产物（1000bp多点）切胶回收后连接pMD19-T simple载体（体系：载体1uL，PCR产物4uL，Solution I 5uL），16 ℃连接1h（说明书要求30min），先后转化DH5α感受态（鼎国）和Top10（天根），涂氨苄平板，都不长菌落。
请各位虫友帮忙分析一下，感激不尽！
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1楼 2013-08-25 19:39:22
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weithermo

新虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-27 22:28:32
没有转化子刻有多种原因，因而尽量用阳性对照帮你查找原因。首先，就象有人建议的一样，要知道PCR所用的DNA聚合酶。并使其和链接载体匹配。Taq之类的每要连到TA克隆载体，而Phusion和Pfu不产生多余的A，是钝端连接。你可以试一下赛默飞世尔的CloneJET PCR 的克隆试剂盒，无论钝端和粘端都何以。5到10分钟室温处理后即可转化。此试剂盒的另个好处是生长的菌落99%都含有克隆·片段。建议每次转化都用很少量的质粒做阳性对照。
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16楼2013-08-27 03:27:49
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guxinhan123

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-25 22:38:45
M110935: 金币+1, ★有帮助, 载体是新买的，目前怀疑是感受态的问题，在重新做。谢谢 2013-08-26 14:09:16
换个新的载体或者重做感受态试下
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2楼2013-08-25 21:11:05
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子墨无极

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
回收产物浓度和纯度怎么样
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追求无止境
3楼2013-08-25 22:04:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助, 用rTaq酶，前面做的时候没设对照，后面会试试，谢谢。 2013-08-26 14:10:13
PCR是用的Taq酶吗？PCR产物回收后定量，按照浓度建立连接体系。此外，连接和转化是最好有正负对照。如果目标克隆什么都不长，硬参考正对照是否做出来。
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4楼2013-08-25 23:21:55
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查看全部 18 个回答
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