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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆求助
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M110935

金虫 (小有名气)

[求助] TA克隆求助

本人前面做TA克隆，将PCR产物（1000bp多点）切胶回收后连接pMD19-T simple载体（体系：载体1uL，PCR产物4uL，Solution I 5uL），16 ℃连接1h（说明书要求30min），先后转化DH5α感受态（鼎国）和Top10（天根），涂氨苄平板，都不长菌落。
请各位虫友帮忙分析一下，感激不尽！
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1楼 2013-08-25 19:39:22
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M110935

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by wang6rrtoy at 2013-08-26 17:06:45
在下也是用的pMD-19，因为我的目的片段至于250bp所以16度链接30min就好了   菌能长出来，但是比较奇葩的是没有蓝斑，但是菌液PCR能P出来，问过卖试剂盒的，他说能P出来就说明我的链接效率很高。你的1000bp的话估计得 ...

谢谢回复。前一次我还特地离心去掉大部分培养基，然后重悬。每次涂板都用200uL
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13楼2013-08-26 18:39:57
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guxinhan123

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-25 22:38:45
M110935: 金币+1, ★有帮助, 载体是新买的，目前怀疑是感受态的问题，在重新做。谢谢 2013-08-26 14:09:16
换个新的载体或者重做感受态试下
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2楼2013-08-25 21:11:05
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子墨无极

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
回收产物浓度和纯度怎么样
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追求无止境
3楼2013-08-25 22:04:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助, 用rTaq酶，前面做的时候没设对照，后面会试试，谢谢。 2013-08-26 14:10:13
PCR是用的Taq酶吗？PCR产物回收后定量，按照浓度建立连接体系。此外，连接和转化是最好有正负对照。如果目标克隆什么都不长，硬参考正对照是否做出来。
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4楼2013-08-25 23:21:55
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