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M110935

金虫 (小有名气)

应助: 3 (幼儿园)
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帖子: 168
在线: 27.8小时
虫号: 1949727
注册: 2012-08-21
性别: GG
专业: 动物遗传学

[求助] TA克隆求助

本人前面做TA克隆，将PCR产物（1000bp多点）切胶回收后连接pMD19-T simple载体（体系：载体1uL，PCR产物4uL，Solution I 5uL），16 ℃连接1h（说明书要求30min），先后转化DH5α感受态（鼎国）和Top10（天根），涂氨苄平板，都不长菌落。
请各位虫友帮忙分析一下，感激不尽！

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1楼 2013-08-25 19:39:22

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

hl16010921

木虫 (正式写手)

应助: 100 (初中生)
金币: 2218.4
红花: 8
帖子: 343
在线: 285.2小时
虫号: 2514830
注册: 2013-06-20
性别: GG
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-27 15:15:58
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:28:37

建议：
1.设立其他质粒的阳性对照。实验室随便找个同抗性质粒，大倍数稀释（100倍至1000倍），作为对照。
2.感受态的阴性对照（无质粒）抗性平板不生长（防止抗生素失效引起的假阳性），还要用无抗性平板看热激后感受态细胞的存活情况
3.4℃连接过夜（PCR产物的比例可以提高，我一般都是1:10~1:20左右）效率低的话就4℃多放几天，我做过1周的，没事。
4.转化时的热激时间影响很大，我一般是45s。你可以参照2中的菌落数，调整。
5.转化时的晃动，尤其是剧烈的摇晃，跑步上下楼等。冰浴。扩增的转速不可过快（千万别放抗生素）