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[求助]
TA克隆求助
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本人前面做TA克隆，将PCR产物（1000bp多点）切胶回收后连接pMD19-T simple载体（体系：载体1uL，PCR产物4uL，Solution I 5uL），16 ℃连接1h（说明书要求30min），先后转化DH5α感受态（鼎国）和Top10（天根），涂氨苄平板，都不长菌落。 请各位虫友帮忙分析一下，感激不尽！ |
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hl16010921
木虫 (正式写手)
- 应助: 100 (初中生)
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- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-27 15:15:58
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:28:37
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M110935: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-27 15:15:58
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:28:37
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建议： 1.设立其他质粒的阳性对照。实验室随便找个同抗性质粒，大倍数稀释（100倍至1000倍），作为对照。 2.感受态的阴性对照（无质粒）抗性平板不生长（防止抗生素失效引起的假阳性），还要用无抗性平板看热激后感受态细胞的存活情况 3.4℃连接过夜（PCR产物的比例可以提高，我一般都是1:10~1:20左右）效率低的话就4℃多放几天，我做过1周的，没事。 4.转化时的热激时间影响很大，我一般是45s。你可以参照2中的菌落数，调整。 5.转化时的晃动，尤其是剧烈的摇晃，跑步上下楼等。冰浴。扩增的转速不可过快（千万别放抗生素） |
17楼2013-08-27 09:11:34
guxinhan123
银虫 (正式写手)
- 应助: 60 (初中生)
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- 专业: 中药资源
2楼2013-08-25 21:11:05
3楼2013-08-25 22:04:26
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
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- 专业: 生物化学
4楼2013-08-25 23:21:55
