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美丽的家园

金虫 (正式写手)

[求助] 放线菌DNA 提取不出来,第一次做这方面的,没经验,还望指正

???:
a. ??TE??????????????????Σ???????1000 ??L TE????????????12,000   r/min????2 min???????壬???l?κ???????200 ??L TE?????????;
b. ????100  ??L????(10 mg/mL TE???)?????У?36?????30 min????????????30 min;
c. ????20  ??L?????K(5 mg/mL????)??55?????2 h?????????30 min;
d. ????150 ??L10% SDS??65?????30 min?????????30 min;
e. ??????????????/??????????12,000 r/min????5 min????????壬??????;
f. ????????????????????12,000 r/min????5 min?????????;
g. ????0.1?? 3M NaAc???????????2???????????é?20?? 30 min??12,000 r/min????5 min??????;
h. 75%??????2??3?Σ?????????20 ??LTE???DNA??4?汣?档
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小小亚杰

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
美丽的家园: 金币+3 2013-08-18 11:08:06
引用回帖:
3楼: Originally posted by 美丽的家园 at 2013-08-17 09:43:58
少量提取,看不见DNA,怎么判断有没有呢?没有的话,后续步骤岂不没意义...

你PCR试一下就知道了。
5楼2013-08-18 00:29:46
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小小亚杰

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
美丽的家园: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-08-17 09:40:31
酶解法就行了。
如果是少量提取,你溶菌酶37℃放置1小时;大量提取最好37℃摇床上震荡3小时左右,不要怕弄断DNA。
你溶菌酶处理后要看见菌体溶解再往下做。
PK不用2h的,30min也行。
别的操作大体都行,推荐你看一下《一种简单有效的适于PCR操作的放线菌DNA提取方法》这篇文献,可以自己适当修改。
还有少量提取的时侯,除非菌体酶解很彻底,一般看不见DNA,但是溶解在35ul TE中PCR加0.8ul左右当模板没问题。
2楼2013-08-17 00:26:26
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美丽的家园

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小小亚杰 at 2013-08-17 00:26:26
酶解法就行了。
如果是少量提取,你溶菌酶37℃放置1小时;大量提取最好37℃摇床上震荡3小时左右,不要怕弄断DNA。
你溶菌酶处理后要看见菌体溶解再往下做。
PK不用2h的,30min也行。
别的操作大体都行,推荐你看 ...

少量提取,看不见DNA,怎么判断有没有呢?没有的话,后续步骤岂不没意义
3楼2013-08-17 09:43:58
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
美丽的家园: 金币+5 2013-08-17 11:32:39
美丽的家园: 金币+2 2013-08-18 11:07:56
我们用的是试剂盒,专门适用格兰氏阳性菌的,比一般的试剂盒效果好出不少,但是分成各步不知道是哪一步改变较大,你查阅下相关文献

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2013-08-17 11:09:00
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