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一株芽孢杆菌的DNA提取问题
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我都要哭了，提了两次DNA什么都没提出来，心好累啊！ 这几天在提实验菌种的DNA，第一次除了Mark什么都没有。于是我又换了一种方法，还是没做出来，提了一种不知道是什么的DNA，愁得我啊。 只能把步骤列出来，请各位大神帮忙看看我是哪步出了问题。 该菌是芽孢杆菌，应该是革兰氏阳性菌种。 第一次提步骤： 接一环斜面活化的菌株于5mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中,30℃ 120rpm振荡培养16h后,取1.5ml培养物于1.5mlEP管中，以12,000r/min离心5min,去上清液,沉淀用500微升TE重悬菌体,加入1 mg/mL溶菌酶,37℃温浴30min。加入1/10体积10%SDS和适量的蛋白酶K,混匀后置于37℃温浴lh,然后用等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇抽提3次。取上清液加入两倍体积的无水乙醇,4℃过夜沉淀DNA,12,000r/min离心15min,最后用70%乙醇洗涤1次,置于室温自然干燥。将沉淀溶于适量的含10微升/mL RNaseA的TE中,于-20℃保存备用。 第二次提步骤： 接一环斜面活化的菌株于5mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中,33℃ 180rpm振荡培养16h后，取1ml加入1.5ml的EP管中7500rpm 5min, 弃上清。细菌沉淀加入TE 567ul 重悬, 加入10%SDS 30ul 和20mg / ml 蛋白酶K 3ul，于37℃温育1.4h, 加入5mol/ L NaCl 100ul混匀后, CTAB/ NaCl 80ul 溶液混匀, 于65℃温育10min,补加氯仿/ 异戊醇至EP管1.5ml处,充分振荡使呈乳浊液, 静置2min 8000rpm离心5min。取700微升上清液转入一个新管加等体积的酚/氯仿/ 异戊醇, 混匀, 静置2min 8000rpm离心5min, 取500微升上清液再转入一只新管中, 发现界面仍有少量蛋白膜，取300微升上清液再转入一只新管中加等体积的酚/氯仿/ 异戊醇, 混匀, 静置2min 8000rpm离心5min，发现界面无蛋白膜。取上清加入其0.6 体积异丙醇, 轻轻混合, 温室静止5min，离心5min, 弃上清, 加入1.0ml 70% 乙醇洗涤1min, 12000pm离心, 弃上清, 过夜自然晾干，将沉淀的DNA溶于100ul 的TE中，4℃两天。 再跑电泳就出现图片所看到的情况，不知道到底哪里出错了。只有第一孔和最后一孔没加样，请各位大神帮忙看下。谢谢！  未命名1.jpg [ Last edited by 放肆猫某人 on 2013-7-27 at 13:04 ] |
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5楼2013-07-31 20:05:54
runrain
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【答案】应助回帖
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用这个方法试试看！ DNA的提取（CTAB法）： 1、 样品的研磨 （1） 植物样品，称取0.2g，于研钵中加入液氮迅速研磨，（尽量选择新鲜嫩叶等易研磨的组织，但有时应根据具体实验目的调整）； （2） 易于刮取的真菌和细菌可用新鲜的固体培养物，刮取培养物适量，加入65℃预热的抽提buffer 300μl，直接研磨（不用加液氮） （3） 不易刮取的真菌和细菌，可用液体培养物，离心收集菌体，尽量去除培养液（可用滤纸或纸巾吸干），对于分泌色素、多糖较多的菌株可用无菌水或生理盐水清洗2~3次，转入研钵，加入65℃预热的抽提buffer 300μl，直接研磨（不用加液氮）。 （样品量一定要适中，过少，提取的DNA的量就少；过多，抽提buffer与样品作用不充分，提取的DNA将含有较多杂质。研磨过程时间既不能过长又要充分磨匀） 2、 将65℃预热的抽提buffer加入研钵或补充至600μl，稍研磨混匀，迅速转入离心管中。 3、 于65℃水中温育30min，期间不时摇动（上下翻转）。（防止后续加入氯仿-异戊醇混合液时喷出） 4、 于冰上冷却5min，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻摇至溶液呈乳化状态。 5、 12000g，冷却离心5~10min。 6、 取上清，用等体积氯仿：异戊醇（24:1）抽提，12000g，冷冻离心5~10min。 7、 取上清，加入1/10体积的3mol/L NaAc及1.5~2体积预冷的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇，混匀，于-20℃冰箱中沉淀20min。 8、 12000g，冷冻离心10min，去除上清。 9、 沉淀加500μl 70%酒精，洗涤一次，冷冻离心5~10min，去除上清。（可倒置在纸巾上使液体流尽，勿使DNA沉淀倒出） 10、 晾干，在空气中使核酸沉淀干燥。（干燥的标志为白色沉淀变为半透明或透明，闻不到酒精味。切勿过度干燥，否则DNA很难重新溶解） 11、 用适量ddH2O或TE with/without RNase（10μg/ml RNase A, pH 8.0）重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。（最好放置于37℃消解RNA 2~3hr） CTAB法提取总DNA溶液配制 一、2× CTAB抽提buffer CTAB 2%（m/v） Tris-HCl(pH 8.0) 10mM EDTA(pH 8.0) 20mM NaCl 1.4 巯基乙醇 0.2%（v/v） 配制方法： 称取CTAB 2g，NaCl 8.18g，量取1M Tris-HCl（pH 8.0）母液10ml，0.5M EDTA(pH 8.0)母液4ml，巯基乙醇0.2ml，加无菌ddH2O定容至100ml。于室温保存，可在几年内保持稳定。 二、氯仿/异戊醇混合液 氯仿：异戊醇 24:1 三、TE缓冲液 Tris-HCl(pH 8.0) 10mM EDTA(pH 8.0) 1mM 配制方法： 吸取0.5M EDTA(pH 8.0)母液0.2ml，1M Tris-HCl(pH 8.0)母液1ml，加ddH2O定容至100ml。保存于-20℃。（for TE with RNase：add RNase A 10mg/ml 母液0.1ml） 四、NaAc溶液 3M NaAc pH 5.2 配制方法：500ml ddH20中溶解40.81g NaAc•3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。 |
2楼2013-07-27 20:32:26
Sthunder
木虫 (正式写手)
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3楼2013-07-27 21:11:08
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