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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一株芽孢杆菌的DNA提取问题
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放肆猫某人

铜虫 (小有名气)

[求助] 一株芽孢杆菌的DNA提取问题

我都要哭了，提了两次DNA什么都没提出来，心好累啊！
这几天在提实验菌种的DNA，第一次除了Mark什么都没有。于是我又换了一种方法，还是没做出来，提了一种不知道是什么的DNA，愁得我啊。
只能把步骤列出来，请各位大神帮忙看看我是哪步出了问题。

该菌是芽孢杆菌，应该是革兰氏阳性菌种。
第一次提步骤：
接一环斜面活化的菌株于5mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中,30℃ 120rpm振荡培养16h后,取1.5ml培养物于1.5mlEP管中，以12,000r/min离心5min,去上清液,沉淀用500微升TE重悬菌体,加入1 mg/mL溶菌酶,37℃温浴30min。加入1/10体积10%SDS和适量的蛋白酶K,混匀后置于37℃温浴lh,然后用等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇抽提3次。取上清液加入两倍体积的无水乙醇,4℃过夜沉淀DNA,12,000r/min离心15min,最后用70%乙醇洗涤1次,置于室温自然干燥。将沉淀溶于适量的含10微升/mL RNaseA的TE中,于-20℃保存备用。

第二次提步骤：
接一环斜面活化的菌株于5mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中,33℃ 180rpm振荡培养16h后，取1ml加入1.5ml的EP管中7500rpm  5min, 弃上清。细菌沉淀加入TE 567ul 重悬, 加入10%SDS 30ul 和20mg / ml 蛋白酶K 3ul，于37℃温育1.4h, 加入5mol/ L NaCl 100ul混匀后, CTAB/ NaCl 80ul 溶液混匀, 于65℃温育10min,补加氯仿/ 异戊醇至EP管1.5ml处,充分振荡使呈乳浊液, 静置2min 8000rpm离心5min。取700微升上清液转入一个新管加等体积的酚/氯仿/ 异戊醇, 混匀, 静置2min 8000rpm离心5min, 取500微升上清液再转入一只新管中, 发现界面仍有少量蛋白膜，取300微升上清液再转入一只新管中加等体积的酚/氯仿/ 异戊醇, 混匀, 静置2min 8000rpm离心5min，发现界面无蛋白膜。取上清加入其0.6 体积异丙醇, 轻轻混合, 温室静止5min，离心5min, 弃上清, 加入1.0ml 70% 乙醇洗涤1min, 12000pm离心, 弃上清, 过夜自然晾干，将沉淀的DNA溶于100ul 的TE中，4℃两天。
再跑电泳就出现图片所看到的情况，不知道到底哪里出错了。只有第一孔和最后一孔没加样，请各位大神帮忙看下。谢谢！
一株芽孢杆菌的DNA提取问题
未命名1.jpg

[ Last edited by 放肆猫某人 on 2013-7-27 at 13:04 ]
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1楼 2013-07-27 12:58:31
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runrain

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
放肆猫某人(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-28 16:05:06
用这个方法试试看！


DNA的提取（CTAB法）：
1、        样品的研磨
（1）        植物样品，称取0.2g，于研钵中加入液氮迅速研磨，（尽量选择新鲜嫩叶等易研磨的组织，但有时应根据具体实验目的调整）；
（2）        易于刮取的真菌和细菌可用新鲜的固体培养物，刮取培养物适量，加入65℃预热的抽提buffer 300μl，直接研磨（不用加液氮）
（3）        不易刮取的真菌和细菌，可用液体培养物，离心收集菌体，尽量去除培养液（可用滤纸或纸巾吸干），对于分泌色素、多糖较多的菌株可用无菌水或生理盐水清洗2~3次，转入研钵，加入65℃预热的抽提buffer 300μl，直接研磨（不用加液氮）。
（样品量一定要适中，过少，提取的DNA的量就少；过多，抽提buffer与样品作用不充分，提取的DNA将含有较多杂质。研磨过程时间既不能过长又要充分磨匀）
2、        将65℃预热的抽提buffer加入研钵或补充至600μl，稍研磨混匀，迅速转入离心管中。
3、        于65℃水中温育30min，期间不时摇动（上下翻转）。（防止后续加入氯仿-异戊醇混合液时喷出）
4、        于冰上冷却5min，加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻摇至溶液呈乳化状态。
5、        12000g，冷却离心5~10min。
6、        取上清，用等体积氯仿：异戊醇（24:1）抽提，12000g，冷冻离心5~10min。
7、        取上清，加入1/10体积的3mol/L NaAc及1.5~2体积预冷的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇，混匀，于-20℃冰箱中沉淀20min。
8、        12000g，冷冻离心10min，去除上清。
9、        沉淀加500μl 70%酒精，洗涤一次，冷冻离心5~10min，去除上清。（可倒置在纸巾上使液体流尽，勿使DNA沉淀倒出）
10、        晾干，在空气中使核酸沉淀干燥。（干燥的标志为白色沉淀变为半透明或透明，闻不到酒精味。切勿过度干燥，否则DNA很难重新溶解）
11、        用适量ddH2O或TE with/without RNase（10μg/ml RNase A, pH 8.0）重新溶解核酸，振荡，贮存于-20℃。（最好放置于37℃消解RNA 2~3hr）

CTAB法提取总DNA溶液配制
一、2× CTAB抽提buffer
CTAB                        2%（m/v）
Tris-HCl(pH 8.0)            10mM
EDTA(pH 8.0)                20mM
NaCl                        1.4
巯基乙醇                    0.2%（v/v）
配制方法：
称取CTAB 2g，NaCl 8.18g，量取1M Tris-HCl（pH 8.0）母液10ml，0.5M EDTA(pH 8.0)母液4ml，巯基乙醇0.2ml，加无菌ddH2O定容至100ml。于室温保存，可在几年内保持稳定。
二、氯仿/异戊醇混合液
氯仿：异戊醇 24:1
三、TE缓冲液
Tris-HCl(pH 8.0)         10mM
EDTA(pH 8.0)             1mM
配制方法：
吸取0.5M EDTA(pH 8.0)母液0.2ml，1M Tris-HCl(pH 8.0)母液1ml，加ddH2O定容至100ml。保存于-20℃。（for TE with RNase：add RNase A 10mg/ml 母液0.1ml）
四、NaAc溶液
3M NaAc
pH 5.2
配制方法：500ml ddH20中溶解40.81g NaAc•3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。
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2楼2013-07-27 20:32:26
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-28 16:05:15
方法2是很常见的CTAB发提取DNA，方法应该是没有问题的，但由于枯草是G+菌，建议用液氮研磨法破裂后，再进行下步实验。但根据你胶结果，其中有个样品已经提出了DNA，所以我也不确定是这个原因，试试吧，方法是肯定没问题的！Good luck！

PS：最后没必要4℃两天，不过也没什么影响！
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互助互励，共奋共进！！
3楼2013-07-27 21:11:08
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放肆猫某人

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by runrain at 2013-07-27 20:32:26
用这个方法试试看！


DNA的提取（CTAB法）：
1、        样品的研磨
（1）        植物样品，称取0.2g，于研钵中加入液氮迅速研磨，（尽量选择新鲜嫩叶等易研磨的组织，但有时应根据具体实验目的调整）；
（2）        易于刮取的 ...

谢谢你啦 最近都在提DNA 没上网呢 昨天才把DNA提出来 就比上次多加了溶菌酶~~~小开心~
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4楼2013-07-31 20:04:47
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放肆猫某人

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-27 21:11:08
方法2是很常见的CTAB发提取DNA，方法应该是没有问题的，但由于枯草是G+菌，建议用液氮研磨法破裂后，再进行下步实验。但根据你胶结果，其中有个样品已经提出了DNA，所以我也不确定是这个原因，试试吧，方法是肯定没 ...

谢谢啦~~我后来加了溶菌酶之后就提出来了。现在才看到你们发给我的方法，很感谢~
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5楼2013-07-31 20:05:54
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1321818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 放肆猫某人 at 2013-07-31 20:04:47
谢谢你啦 最近都在提DNA 没上网呢 昨天才把DNA提出来 就比上次多加了溶菌酶~~~小开心~...

请问楼主，你加的溶菌酶量是多少？因为我最近也要提取芽孢杆菌DNA，但是只有溶菌酶（粉状），正在苦恼不知道该怎么用它，麻烦楼主教教我，谢谢思密达~
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6楼2015-11-12 15:52:27
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1321818

新虫 (初入文坛)
请问楼主，你加的溶菌酶量是多少？因为我最近也要提取芽孢杆菌DNA，但是只有溶菌酶（粉状），正在苦恼不知道该怎么用它，麻烦楼主教教我，谢谢思密达~
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7楼2015-11-12 15:54:16
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