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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)

[求助] DGGE总是做不出来，求高手指点，急急急！！！

已经做了三次DGGE了，每次都是这样，真心不知道是什么原因，高手帮帮忙！！！
提取石油污染土壤总DNA，细菌通用引物Pcr扩增条带250bp左右，用的是8%的胶，梯度是40%和70%，80V跑了14h，请各位高手指点，问题到底出在哪？
DGGE总是做不出来，求高手指点，急急急！！！
2013-7-17 DGGE_副本.jpg
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1楼 2013-07-17 17:46:45
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
刘小皮爱喝奶(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 11:34:27
PCR产物不太好。我建议你先用16S通用引物扩出16S rDNA片段，再以此为模板，用GC夹引物扩增V3区，跑胶试试，也许这样会导致多样性有所减少，但是可以看看条带跑的怎么样，和之前的作个比较。这样的方法也有文献依据
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9楼2013-07-19 14:07:31
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枫叶丹

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
刘小皮爱喝奶(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 17:47:50
这个要从PCR看起，有时候要从提DNA看起，可能存在的问题很多，不好说
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2楼2013-07-18 08:29:35
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
刘小皮爱喝奶(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 17:48:07
提取的总DNA质量怎么样？你是扩的V3区吗？引物5'端加GC夹了吗？扩增目的片段时PCR产物质量好不好？如楼上所说，这些只是前面可能会遇到的问题，还有很多其他影响因素。建议你把你的详细步骤说一下，才好帮助你的。
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3楼2013-07-18 08:53:21
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lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
胶上都没条带，应该是前期PCR的问题~
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4楼2013-07-18 11:36:07
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