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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)

[求助] DGGE总是做不出来,求高手指点,急急急!!!

已经做了三次DGGE了,每次都是这样,真心不知道是什么原因,高手帮帮忙!!!
提取石油污染土壤总DNA,细菌通用引物Pcr扩增条带250bp左右,用的是8%的胶,梯度是40%和70%,80V跑了14h,请各位高手指点,问题到底出在哪?
DGGE总是做不出来,求高手指点,急急急!!!
2013-7-17 DGGE_副本.jpg
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
刘小皮爱喝奶(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-20 11:34:27
PCR产物不太好。我建议你先用16S通用引物扩出16S rDNA片段,再以此为模板,用GC夹引物扩增V3区,跑胶试试,也许这样会导致多样性有所减少,但是可以看看条带跑的怎么样,和之前的作个比较。这样的方法也有文献依据
9楼2013-07-19 14:07:31
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普通回帖

枫叶丹

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
刘小皮爱喝奶(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-07-18 17:47:50
这个要从PCR看起,有时候要从提DNA看起,可能存在的问题很多,不好说
2楼2013-07-18 08:29:35
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
刘小皮爱喝奶(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-07-18 17:48:07
提取的总DNA质量怎么样?你是扩的V3区吗?引物5'端加GC夹了吗?扩增目的片段时PCR产物质量好不好?如楼上所说,这些只是前面可能会遇到的问题,还有很多其他影响因素。建议你把你的详细步骤说一下,才好帮助你的。
3楼2013-07-18 08:53:21
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lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
胶上都没条带,应该是前期PCR的问题~
4楼2013-07-18 11:36:07
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 枫叶丹 at 2013-07-18 08:29:35
这个要从PCR看起,有时候要从提DNA看起,可能存在的问题很多,不好说

我用的是美国MPBIO进口土壤DNA提取试剂盒提取的石油污染土壤总DNA,第一张是DNA跑胶图片(15000的Marker),第二张是Pcr产物跑胶图片(用的是2000的Marker,但我比对了一下,200~250bp左右),引物用的是
357F-GC-clamp        5‘-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG        
518R                 ATT ACC GCG GCT GCT GG       
麻烦各位再帮我看看。。。
5楼2013-07-18 15:00:09
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by mirror3895 at 2013-07-18 08:53:21
提取的总DNA质量怎么样?你是扩的V3区吗?引物5'端加GC夹了吗?扩增目的片段时PCR产物质量好不好?如楼上所说,这些只是前面可能会遇到的问题,还有很多其他影响因素。建议你把你的详细步骤说一下,才好帮助你的。

我用的是美国MPBIO进口土壤DNA提取试剂盒提取的石油污染土壤总DNA,第一张是DNA跑胶图片(15000的Marker),第二张是Pcr产物跑胶图片(用的是2000的Marker,但我比对了一下,200~250bp左右),引物用的是
357F-GC-clamp        5‘-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG        
518R                 ATT ACC GCG GCT GCT GG       
麻烦各位再帮我看看。。。
6楼2013-07-18 15:01:31
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by mirror3895 at 2013-07-18 08:53:21
提取的总DNA质量怎么样?你是扩的V3区吗?引物5'端加GC夹了吗?扩增目的片段时PCR产物质量好不好?如楼上所说,这些只是前面可能会遇到的问题,还有很多其他影响因素。建议你把你的详细步骤说一下,才好帮助你的。

我用的是美国MPBIO进口土壤DNA提取试剂盒提取的石油污染土壤总DNA,第一张是DNA跑胶图片(15000的Marker),第二张是Pcr产物跑胶图片(用的是2000的Marker,但我比对了一下,200~250bp左右),引物用的是
357F-GC-clamp        5‘-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG        
518R                 ATT ACC GCG GCT GCT GG       
麻烦各位再帮我看看。。。
7楼2013-07-18 15:05:20
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)

第一张是DNA跑胶图片(15000的Marker),第二张是Pcr产物跑胶图片(用的是2000的Marker,但我比对了一下,200~250bp左右),引物用的是
357F-GC-clamp        5‘-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG        
518R                 ATT ACC GCG GCT GCT GG       
麻烦各位再帮我看看。。。
DGGE总是做不出来,求高手指点,急急急!!!-1
20113-6-5土壤中总DNA_副本.jpg


DGGE总是做不出来,求高手指点,急急急!!!-2
2013-6-14   DGGE-PCR_副本.jpg

8楼2013-07-18 15:07:44
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by mirror3895 at 2013-07-19 14:07:31
PCR产物不太好。我建议你先用16S通用引物扩出16S rDNA片段,再以此为模板,用GC夹引物扩增V3区,跑胶试试,也许这样会导致多样性有所减少,但是可以看看条带跑的怎么样,和之前的作个比较。这样的方法也有文献依据

这样的话会不会导致我DGGE做出的结果是不全的呢?我DGGE一直没做出来会不会是因为制胶出现了问题?
10楼2013-07-20 15:22:01
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