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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)

[求助] DGGE总是做不出来，求高手指点，急急急！！！

已经做了三次DGGE了，每次都是这样，真心不知道是什么原因，高手帮帮忙！！！
提取石油污染土壤总DNA，细菌通用引物Pcr扩增条带250bp左右，用的是8%的胶，梯度是40%和70%，80V跑了14h，请各位高手指点，问题到底出在哪？
DGGE总是做不出来，求高手指点，急急急！！！
2013-7-17 DGGE_副本.jpg
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1楼 2013-07-17 17:46:45
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
刘小皮爱喝奶(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 11:34:27
PCR产物不太好。我建议你先用16S通用引物扩出16S rDNA片段，再以此为模板，用GC夹引物扩增V3区，跑胶试试，也许这样会导致多样性有所减少，但是可以看看条带跑的怎么样，和之前的作个比较。这样的方法也有文献依据
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9楼2013-07-19 14:07:31
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枫叶丹

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
刘小皮爱喝奶(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 17:47:50
这个要从PCR看起，有时候要从提DNA看起，可能存在的问题很多，不好说
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2楼2013-07-18 08:29:35
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
刘小皮爱喝奶(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-18 17:48:07
提取的总DNA质量怎么样？你是扩的V3区吗？引物5'端加GC夹了吗？扩增目的片段时PCR产物质量好不好？如楼上所说，这些只是前面可能会遇到的问题，还有很多其他影响因素。建议你把你的详细步骤说一下，才好帮助你的。
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3楼2013-07-18 08:53:21
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lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
胶上都没条带，应该是前期PCR的问题~
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4楼2013-07-18 11:36:07
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 枫叶丹 at 2013-07-18 08:29:35
这个要从PCR看起，有时候要从提DNA看起，可能存在的问题很多，不好说

我用的是美国MPBIO进口土壤DNA提取试剂盒提取的石油污染土壤总DNA，第一张是DNA跑胶图片（15000的Marker），第二张是Pcr产物跑胶图片（用的是2000的Marker，但我比对了一下，200~250bp左右），引物用的是
357F-GC-clamp        5‘-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG        
518R                 ATT ACC GCG GCT GCT GG       
麻烦各位再帮我看看。。。
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5楼2013-07-18 15:00:09
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mirror3895 at 2013-07-18 08:53:21
提取的总DNA质量怎么样？你是扩的V3区吗？引物5'端加GC夹了吗？扩增目的片段时PCR产物质量好不好？如楼上所说，这些只是前面可能会遇到的问题，还有很多其他影响因素。建议你把你的详细步骤说一下，才好帮助你的。

我用的是美国MPBIO进口土壤DNA提取试剂盒提取的石油污染土壤总DNA，第一张是DNA跑胶图片（15000的Marker），第二张是Pcr产物跑胶图片（用的是2000的Marker，但我比对了一下，200~250bp左右），引物用的是
357F-GC-clamp        5‘-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG        
518R                 ATT ACC GCG GCT GCT GG       
麻烦各位再帮我看看。。。
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6楼2013-07-18 15:01:31
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mirror3895 at 2013-07-18 08:53:21
提取的总DNA质量怎么样？你是扩的V3区吗？引物5'端加GC夹了吗？扩增目的片段时PCR产物质量好不好？如楼上所说，这些只是前面可能会遇到的问题，还有很多其他影响因素。建议你把你的详细步骤说一下，才好帮助你的。

我用的是美国MPBIO进口土壤DNA提取试剂盒提取的石油污染土壤总DNA，第一张是DNA跑胶图片（15000的Marker），第二张是Pcr产物跑胶图片（用的是2000的Marker，但我比对了一下，200~250bp左右），引物用的是
357F-GC-clamp        5‘-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG        
518R                 ATT ACC GCG GCT GCT GG       
麻烦各位再帮我看看。。。
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7楼2013-07-18 15:05:20
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)
第一张是DNA跑胶图片（15000的Marker），第二张是Pcr产物跑胶图片（用的是2000的Marker，但我比对了一下，200~250bp左右），引物用的是
357F-GC-clamp        5‘-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG        
518R                 ATT ACC GCG GCT GCT GG       
麻烦各位再帮我看看。。。
DGGE总是做不出来，求高手指点，急急急！！！-1
20113-6-5土壤中总DNA_副本.jpg


DGGE总是做不出来，求高手指点，急急急！！！-2
2013-6-14   DGGE-PCR_副本.jpg
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8楼2013-07-18 15:07:44
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刘小皮爱喝奶

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by mirror3895 at 2013-07-19 14:07:31
PCR产物不太好。我建议你先用16S通用引物扩出16S rDNA片段，再以此为模板，用GC夹引物扩增V3区，跑胶试试，也许这样会导致多样性有所减少，但是可以看看条带跑的怎么样，和之前的作个比较。这样的方法也有文献依据

这样的话会不会导致我DGGE做出的结果是不全的呢？我DGGE一直没做出来会不会是因为制胶出现了问题？
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10楼2013-07-20 15:22:01
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