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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求高手帮忙看看我的DGGE为什么每次跑出来都是两条深深的条带啊
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幸福gh

新虫 (初入文坛)

[求助] 求高手帮忙看看我的DGGE为什么每次跑出来都是两条深深的条带啊

我做土壤总DNA多样性分析
DNA用试剂盒提的没什么问题
巢氏PCR
引物用细菌通用引物8F\1492R      R518\GC338F
1P和2P结果呈上

DGGE 我试了6%、8%、10%的胶，梯度试了40%-60%、30%-50%
电泳时间100V 9h、80V 12h等等，就是常说的乘积差不多是1000
银染
不管什么条件下都是只有两条深深的带，前段有两条淡一点的带。。胶浓度低一点两条带就离得远一些，高一点就近一点。。实质上无任何进展。。

上传的图片是前面做的胶歪的很，最近把灌胶速度调到超级慢。。一点也不歪了。
手机拍的。。条件艰苦。。求高手指点啊。。

是我PCR产物的问题还是什么呢？呜呜呜。。。

1P.jpg



2P.jpg



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1楼2012-10-29 03:24:56
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幸福gh

新虫 (初入文坛)
呜呜。。高手来帮帮忙。。
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2楼2012-10-29 16:30:53
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幸福gh

新虫 (初入文坛)
为什么没有人理我呢。。高手们你们都去哪里了？
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3楼2012-10-31 12:14:02
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elbo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-14 16:25:15
为什么不试试直接用GC夹子引物进行PCR呢。8%胶就可以了，另外灌胶可能有问题吧，最好上传BIORAD的看胶结果。V.H=1230这个许多人采用，而且在正式跑之前都用70V跑半个小时，之后采用100V，120V,80V等等跑，60摄氏度。
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4楼2012-10-31 16:54:17
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幸福gh

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by elbo at 2012-10-31 16:54:17
为什么不试试直接用GC夹子引物进行PCR呢。8%胶就可以了，另外灌胶可能有问题吧，最好上传BIORAD的看胶结果。V.H=1230这个许多人采用，而且在正式跑之前都用70V跑半个小时，之后采用100V，120V,80V等等跑，60摄氏度。

高手
你的意思是直接用带夹子的引物P，然后跑DGGE是么？
那我试试。。
灌胶现在没问题了，泳道跑的很直了，这是半个多月前的手机拍的。。嘿嘿，看着有点。。。
因为我们实验室BIORAD坏掉了，有一个月不能用了，不过扫描的可以的。。。
谢谢高手指点。我再试试。。
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5楼2012-11-04 02:11:39
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elbo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

再给你个建议，前2个和后2个孔不要点样，容易跑歪。
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6楼2012-11-04 12:25:49
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幸福gh

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by elbo at 2012-11-04 12:25:49
再给你个建议，前2个和后2个孔不要点样，容易跑歪。

这是今天做的图。。
6%胶  30-50%变性梯度
左边是DS2000
接着的6条是我换的新引物。。。最下面貌似也是有条带的
空格一个
3条原来的巢氏PCR
3条用您的建议直接用DNA作的PCR。

现在我又迷茫了。。明显的上面有一些细细的条带。。可是下面的条带算什么呢？？呜呜。。求大侠帮忙。。

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7楼2012-11-14 01:40:12
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elbo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

照片最好是伯乐拍出来的结果，那样的结果最好分析。你做的胶，粗看起来不好，有的孔大有的小，而且许多都跑歪了。你把你制胶的详细方法和步骤发上来看看
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8楼2012-11-14 08:00:05
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