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dcb005

金虫 (著名写手)
The coding region of a gene, also known as the coding sequence or CDS (from Coding DNA Sequence), is that portion of a gene's DNA or RNA, composed of exons, that codes for protein
CDS 肯定不含内含子
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21楼2013-06-22 11:56:46
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by dcb005 at 2013-06-22 11:56:46
The coding region of a gene, also known as the coding sequence or CDS (from Coding DNA Sequence), is that portion of a gene's DNA or RNA, composed of exons, that codes for protein
CDS 肯定不含内含 ...

嗯，谢谢，我终于搞清楚了。的确不含内含子的。
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思路决定出路。。。
22楼2013-06-23 08:40:39
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
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20楼: Originally posted by 547star at 2013-06-20 23:54:23
137167741说的没错。看了VERSION     JN391444.1  GI:386956632 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JN391444.1，这是DNA序列。一般说的mRNA是剪切加工成熟的，就是其中1..283和904..2353剪切后连起来的部分，而 ...

嗯，您分析地很点中我的迷惑点！
现在我明白：1 公布的序列有complet cds的并不代表就是只有CDS，可能是含有CDS全长的基因组序列。
2 之前我纠结于自己cDNA扩增的序列，竟然是总基因组DNA，不理解。现在通过分析，自己克隆的基因比对后，就是跟一基因组DNA相似度很高，足可以说明，我的mRNA里有DNA污染。之前，我没想过还会有这种情况

3 现在，我总结原因，一是通过DNAse I消化酶消化RNA中的DNA；二是设计跨内含子的引物，这里关于设计跨内含子的引物，我有点不理解，如附图，当然，我试着做一下就知道了，现在引物还没合成好，呵呵，我很想了解其中的原理是不是跟自己想的一样，希望能得到这位大侠的指点。
大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了
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思路决定出路。。。
23楼2013-06-23 08:54:42
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547star

木虫 (著名写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 08:54:42
嗯，您分析地很点中我的迷惑点！
现在我明白：1 公布的序列有complet cds的并不代表就是只有CDS，可能是含有CDS全长的基因组序列。
2 之前我纠结于自己cDNA扩增的序列，竟然是总基因组DNA，不理解。现在通过分析 ...

普通RT-PCR扩增目的基因，如果是从gDNA而不是mRNA扩增，电泳大小可以大概看出来。而如果是做定量PCR就要考虑用DNaseI之类消化gDNA，或者设计跨内含子引物。跨内含子引物一般只要一条是跨内含子就可以避免从gDNA扩增，它的要求是引物3`端的5-7个碱基是在一个外显子，5`端大约也有20个碱基左右是在另一个外显子，引物是跨了一个内含子，当遇到gDNA时，要么5`端搭上而3·端5-7个碱基没有完全匹配，就应该扩增不了；要3`端搭上gDNA需要的退火温度要比完全匹配的mRNA或cDNA低得多，那时匹配的地方也很多。为了减少非目的片段的扩增，我倾向于按别人积累的经验和知识来设计，3`端至少有2个以上是在另一个外显子，但不能太长，否则有可能以gDNA为模板扩增，第二是扩增片段不要太长--宁可只有一条是跨内含子，那么在即使是人那么大的gDNA也难有其他短序列（扩增长度）上有那么多匹配上下引物的地方了，但是如果扩增区长的话，这种可能就难免了。在NCBI有引物设计软件可以给出跨内含子的引物，并给出可能错误扩增的分析结果。
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为什么
24楼2013-06-23 09:30:07
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 547star at 2013-06-23 09:30:07
普通RT-PCR扩增目的基因，如果是从gDNA而不是mRNA扩增，电泳大小可以大概看出来。而如果是做定量PCR就要考虑用DNaseI之类消化gDNA，或者设计跨内含子引物。跨内含子引物一般只要一条是跨内含子就可以避免从gDNA扩增 ...

嗯，谢谢！我的是普通RT-PCR，mRNA反转录扩增，应该是1600bp左右，从gDNA扩增则约2400bp，的确是可以分开的，但是我这么多次RT-PCR扩增，都是扩的含内含子的gDNA序列，我不做定量PCR，就是想把不含内含子的编码区全长扩出来。
    您觉得可能是我的RNA含有基因组DNA，导致老是扩出我要的酶基因的gDNA的原因吗？
    另外，在NCBI里的引物设计那里，我也试点过那个可以给出跨内含子引物的选项，见图2，但往往出不来引物，提示说明见图3，我也不知道自己哪里设置错了。。。
大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了-1
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大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了-2
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25楼2013-06-23 09:43:39
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547star

木虫 (著名写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 09:43:39
嗯，谢谢！我的是普通RT-PCR，mRNA反转录扩增，应该是1600bp左右，从gDNA扩增则约2400bp，的确是可以分开的，但是我这么多次RT-PCR扩增，都是扩的含内含子的gDNA序列，我不做定量PCR，就是想把不含内含子的编码区全 ...

估计是基因组没测定或者至少是没有对应的mRNA（虽然序列给出了，不是单独以mRNA存在，也有其他相似的mRNA但不同的碱基比较多）,或者你选择项没设计好。
mRNA丰度不足会影响RT-PCR的。考虑到实验是普通的RT-PCR，可以通过其他办法达到目标，解决的路线有，1）以Oligo(dT)来做下游引物扩增，把RT-PCR产物先克隆到克隆载体--比如T-载体，（测序后）在用下游特异引物扩增；2）只有一个内含子，可以再设计1-2条跨内含子的引物，手动设计就好，比如28base各有14base在两个外显子上的互补序列作为引物，分别扩增两个外显子序列，然后再做重叠PCR，或者参考缺失突变的做法，实际也差不多。
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为什么
26楼2013-06-23 10:18:20
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
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26楼: Originally posted by 547star at 2013-06-23 10:18:20
估计是基因组没测定或者至少是没有对应的mRNA（虽然序列给出了，不是单独以mRNA存在，也有其他相似的mRNA但不同的碱基比较多）,或者你选择项没设计好。
mRNA丰度不足会影响RT-PCR的。考虑到实验是普通的RT-PCR，可 ...

您好！谢谢您的耐心和热心帮助！我对第一个解决路线不是很理解，是反转录后，用特异性上游引物和Oligo（dT）引物来做PCR扩增，然后，将此RT-PCR产物克隆至克隆载体，测序初步表明是目的产物后再同时用特异性上游引物和下游引物，以T-载体和目的基因的重组质粒为模版扩增吗？以Oligo(dT)来做下游引物扩增的主要原理是怎样的啊？
    因为反转录的时候，已经有同时用到Oligo（dT）和Ramdom 6 mers引物了，理论上Oligo（dT）引物可以将mRNA调取出来，即反转录液里就算有DNA的污染，应该也会有cDNA存在而扩到不含内含子的CDS的，可是我的PCR产物里，只有含内含子的目的基因，在相应的位置上，不含内含子的CDS产物连个影都没有，我不是很理解。
   
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思路决定出路。。。
27楼2013-06-23 10:57:38
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
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27楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 10:57:38
您好！谢谢您的耐心和热心帮助！我对第一个解决路线不是很理解，是反转录后，用特异性上游引物和Oligo（dT）引物来做PCR扩增，然后，将此RT-PCR产物克隆至克隆载体，测序初步表明是目的产物后再同时用特异性上游引 ...

你的实验流程我没有完全看懂。可能是因为我做PT-PCR较少，比如我不懂你的RT-PCR流程中为什么要水解DNA？

我先就你的你的这贴讨论。在RT-PCR时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo(T)-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。

具体的Oligo(T)引物：建议每20微升反应体系用0.5微克的Oligo(T)。Oligo(T)12-18适用于多数RT-PCR。
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28楼2013-06-23 11:46:00
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
27楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 10:57:38
您好！谢谢您的耐心和热心帮助！我对第一个解决路线不是很理解，是反转录后，用特异性上游引物和Oligo（dT）引物来做PCR扩增，然后，将此RT-PCR产物克隆至克隆载体，测序初步表明是目的产物后再同时用特异性上游引 ...

“ 因为反转录的时候，已经有同时用到Oligo（dT）和Ramdom 6 mers引物了，理论上Oligo（dT）引物可以将mRNA调取出来，即反转录液里就算有DNA的污染，应该也会有cDNA存在而扩到不含内含子的CDS的，可是我的PCR产物里，只有含内含子的目的基因，在相应的位置上，不含内含子的CDS产物连个影都没有，我不是很理解。”
你这句话，我没有完全理解，你是不是说既然用了Oligo（dT）和随机引物反转录出来的mRNA就不该有编码区之外的序列，这可不一定。因为你的转录本是没有在细胞内经过了转录后加工的，也就是说完全有可能存在内含子序列。所以在反转录时要用没有内含子序列的DNA。
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29楼2013-06-23 11:54:45
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我想你说的DNA污染是指转录mRNA时，对吧？
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30楼2013-06-23 11:59:38
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