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lmcyjxs金虫 (正式写手)
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[求助]
大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了
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各位大侠，我要崩溃了，不是说我没之前没看过帖，而是看了帖之后把我搞混了。 1 CDS区到时含不含内含子？有一个老师说不含，一个说含，我看了论坛，两种说法我都好像看过。我认为是不含的。 2 如果CDS区不含内含子，有些基因在NCBI里查到的，标题上注明是全长CDS区，但下面的注释里却显示含有很多个CDS区，基因序列也显示含有多个CDS区，如图1，难道CDS区真含有内含子才是正解？但为什么我克隆了一个基因，反转录得到的，不含内含子了，获得的基因就跟图1情况一样，终止密码子还更多，导致多个CDS区存在，怎么会这样呢？如图2 3 若在一个基因序列里，含有多个CDS区（就是在多个不同位置含终止密码子），连接到表达载体是不是指翻译其识别的第一个CDS？  1.jpg  2.jpg |
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137167741说的没错。看了VERSION JN391444.1 GI:386956632 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JN391444.1，这是DNA序列。一般说的mRNA是剪切加工成熟的，就是其中1..283和904..2353剪切后连起来的部分，而CDS是编码区，是指扣除前后非翻译区的，就是106..283和904..1865连起来的1140bp部分，这部分从ATG开始到TGA结束，正常翻译得到379个氨基酸。与AFJ49141.1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/386956633是可以对应起来的。楼主说有终止密码子，要是是得到的序列缺失或插入，或者不理解公布的序列信息，弄错了，甚至专业里生物偏点，基础知识掌握不够好，PCR扩增的是总基因组DNA，也是可能的。 |
20楼2013-06-20 23:54:23
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普通RT-PCR扩增目的基因，如果是从gDNA而不是mRNA扩增，电泳大小可以大概看出来。而如果是做定量PCR就要考虑用DNaseI之类消化gDNA，或者设计跨内含子引物。跨内含子引物一般只要一条是跨内含子就可以避免从gDNA扩增，它的要求是引物3`端的5-7个碱基是在一个外显子，5`端大约也有20个碱基左右是在另一个外显子，引物是跨了一个内含子，当遇到gDNA时，要么5`端搭上而3·端5-7个碱基没有完全匹配，就应该扩增不了；要3`端搭上gDNA需要的退火温度要比完全匹配的mRNA或cDNA低得多，那时匹配的地方也很多。为了减少非目的片段的扩增，我倾向于按别人积累的经验和知识来设计，3`端至少有2个以上是在另一个外显子，但不能太长，否则有可能以gDNA为模板扩增，第二是扩增片段不要太长--宁可只有一条是跨内含子，那么在即使是人那么大的gDNA也难有其他短序列（扩增长度）上有那么多匹配上下引物的地方了，但是如果扩增区长的话，这种可能就难免了。在NCBI有引物设计软件可以给出跨内含子的引物，并给出可能错误扩增的分析结果。 |
24楼2013-06-23 09:30:07
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估计是基因组没测定或者至少是没有对应的mRNA（虽然序列给出了，不是单独以mRNA存在，也有其他相似的mRNA但不同的碱基比较多）,或者你选择项没设计好。 mRNA丰度不足会影响RT-PCR的。考虑到实验是普通的RT-PCR，可以通过其他办法达到目标，解决的路线有，1）以Oligo(dT)来做下游引物扩增，把RT-PCR产物先克隆到克隆载体--比如T-载体，（测序后）在用下游特异引物扩增；2）只有一个内含子，可以再设计1-2条跨内含子的引物，手动设计就好，比如28base各有14base在两个外显子上的互补序列作为引物，分别扩增两个外显子序列，然后再做重叠PCR，或者参考缺失突变的做法，实际也差不多。 |
26楼2013-06-23 10:18:20
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不知道实验目的是什么。如果是克隆基因，直接拿基因组DNA分别PCR两个外显子区再做重叠PCR（要求扩增外显子的中间那2条引物有比较长的重叠区）。 上游用特异性引物，下游用Oligo(dT)来做RT-PCR，既保证特异性，也保证是从mRNA扩增的；双特异性引物和随机引物，都有可能从基因组DNA扩增。另外mRNA丰度不高或提取质量不高，目的mRNA很少，甚至没有，用的又是特异性引物和随机引物，就可能扩增到基因组DNA，解决的办法是选择目的蛋白表达含量高/意味着目的基因mRNA相对比较多的组织来提取，提取过程也要注意避免mRNA降解。发这么多帖子，就没一个RNA提取的图，也没说明实验意图，也不说明从哪里提取，那是想先弄明白问题再做课题了，那就继续吧；如果只是表达，不一定要做RT-PCR，特别是实验室条件不适合做RNA，做RT-PCR时，直接用高保真酶先分段扩增再做重叠PCR就好了，特别是只有2个片段。 纠结于前面的这些问题，往往会耽误实验的，暂时放下，以后有机会等去到条件好的实验室，也会做出漂亮的实验结果来，不是所有的意外失败会通向新的科学领域，该坚持的时候坚持，该换路线的时候就转过来。 |
42楼2013-06-26 16:22:47