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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

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[求助] 大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了

各位大侠，我要崩溃了，不是说我没之前没看过帖，而是看了帖之后把我搞混了。
   1 CDS区到时含不含内含子？有一个老师说不含，一个说含，我看了论坛，两种说法我都好像看过。我认为是不含的。
   2 如果CDS区不含内含子，有些基因在NCBI里查到的，标题上注明是全长CDS区，但下面的注释里却显示含有很多个CDS区，基因序列也显示含有多个CDS区，如图1，难道CDS区真含有内含子才是正解？但为什么我克隆了一个基因，反转录得到的，不含内含子了，获得的基因就跟图1情况一样，终止密码子还更多，导致多个CDS区存在，怎么会这样呢？如图2
   3 若在一个基因序列里，含有多个CDS区（就是在多个不同位置含终止密码子），连接到表达载体是不是指翻译其识别的第一个CDS？

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思路决定出路。。。

1楼 2013-06-14 16:15:35

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木虫 (著名写手)

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引用回帖:

23楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 08:54:42
嗯，您分析地很点中我的迷惑点！
现在我明白：1 公布的序列有complet cds的并不代表就是只有CDS，可能是含有CDS全长的基因组序列。
2 之前我纠结于自己cDNA扩增的序列，竟然是总基因组DNA，不理解。现在通过分析 ...

普通RT-PCR扩增目的基因，如果是从gDNA而不是mRNA扩增，电泳大小可以大概看出来。而如果是做定量PCR就要考虑用DNaseI之类消化gDNA，或者设计跨内含子引物。跨内含子引物一般只要一条是跨内含子就可以避免从gDNA扩增，它的要求是引物3`端的5-7个碱基是在一个外显子，5`端大约也有20个碱基左右是在另一个外显子，引物是跨了一个内含子，当遇到gDNA时，要么5`端搭上而3·端5-7个碱基没有完全匹配，就应该扩增不了；要3`端搭上gDNA需要的退火温度要比完全匹配的mRNA或cDNA低得多，那时匹配的地方也很多。为了减少非目的片段的扩增，我倾向于按别人积累的经验和知识来设计，3`端至少有2个以上是在另一个外显子，但不能太长，否则有可能以gDNA为模板扩增，第二是扩增片段不要太长--宁可只有一条是跨内含子，那么在即使是人那么大的gDNA也难有其他短序列（扩增长度）上有那么多匹配上下引物的地方了，但是如果扩增区长的话，这种可能就难免了。在NCBI有引物设计软件可以给出跨内含子的引物，并给出可能错误扩增的分析结果。