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lmcyjxs金虫 (正式写手)
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[求助]
大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了
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各位大侠，我要崩溃了，不是说我没之前没看过帖，而是看了帖之后把我搞混了。 1 CDS区到时含不含内含子？有一个老师说不含，一个说含，我看了论坛，两种说法我都好像看过。我认为是不含的。 2 如果CDS区不含内含子，有些基因在NCBI里查到的，标题上注明是全长CDS区，但下面的注释里却显示含有很多个CDS区，基因序列也显示含有多个CDS区，如图1，难道CDS区真含有内含子才是正解？但为什么我克隆了一个基因，反转录得到的，不含内含子了，获得的基因就跟图1情况一样，终止密码子还更多，导致多个CDS区存在，怎么会这样呢？如图2 3 若在一个基因序列里，含有多个CDS区（就是在多个不同位置含终止密码子），连接到表达载体是不是指翻译其识别的第一个CDS？  1.jpg  2.jpg |
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普通RT-PCR扩增目的基因，如果是从gDNA而不是mRNA扩增，电泳大小可以大概看出来。而如果是做定量PCR就要考虑用DNaseI之类消化gDNA，或者设计跨内含子引物。跨内含子引物一般只要一条是跨内含子就可以避免从gDNA扩增，它的要求是引物3`端的5-7个碱基是在一个外显子，5`端大约也有20个碱基左右是在另一个外显子，引物是跨了一个内含子，当遇到gDNA时，要么5`端搭上而3·端5-7个碱基没有完全匹配，就应该扩增不了；要3`端搭上gDNA需要的退火温度要比完全匹配的mRNA或cDNA低得多，那时匹配的地方也很多。为了减少非目的片段的扩增，我倾向于按别人积累的经验和知识来设计，3`端至少有2个以上是在另一个外显子，但不能太长，否则有可能以gDNA为模板扩增，第二是扩增片段不要太长--宁可只有一条是跨内含子，那么在即使是人那么大的gDNA也难有其他短序列（扩增长度）上有那么多匹配上下引物的地方了，但是如果扩增区长的话，这种可能就难免了。在NCBI有引物设计软件可以给出跨内含子的引物，并给出可能错误扩增的分析结果。 |
24楼2013-06-23 09:30:07
laoshi0633
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2楼2013-06-14 16:27:25
laoshi0633
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3楼2013-06-14 16:31:36
lmcyjxs
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4楼2013-06-14 17:07:52
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