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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

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[求助] 大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了

各位大侠，我要崩溃了，不是说我没之前没看过帖，而是看了帖之后把我搞混了。
   1 CDS区到时含不含内含子？有一个老师说不含，一个说含，我看了论坛，两种说法我都好像看过。我认为是不含的。
   2 如果CDS区不含内含子，有些基因在NCBI里查到的，标题上注明是全长CDS区，但下面的注释里却显示含有很多个CDS区，基因序列也显示含有多个CDS区，如图1，难道CDS区真含有内含子才是正解？但为什么我克隆了一个基因，反转录得到的，不含内含子了，获得的基因就跟图1情况一样，终止密码子还更多，导致多个CDS区存在，怎么会这样呢？如图2
   3 若在一个基因序列里，含有多个CDS区（就是在多个不同位置含终止密码子），连接到表达载体是不是指翻译其识别的第一个CDS？

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思路决定出路。。。

1楼 2013-06-14 16:15:35

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木虫 (著名写手)

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引用回帖:

25楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 09:43:39
嗯，谢谢！我的是普通RT-PCR，mRNA反转录扩增，应该是1600bp左右，从gDNA扩增则约2400bp，的确是可以分开的，但是我这么多次RT-PCR扩增，都是扩的含内含子的gDNA序列，我不做定量PCR，就是想把不含内含子的编码区全 ...

估计是基因组没测定或者至少是没有对应的mRNA（虽然序列给出了，不是单独以mRNA存在，也有其他相似的mRNA但不同的碱基比较多）,或者你选择项没设计好。
mRNA丰度不足会影响RT-PCR的。考虑到实验是普通的RT-PCR，可以通过其他办法达到目标，解决的路线有，1）以Oligo(dT)来做下游引物扩增，把RT-PCR产物先克隆到克隆载体--比如T-载体，（测序后）在用下游特异引物扩增；2）只有一个内含子，可以再设计1-2条跨内含子的引物，手动设计就好，比如28base各有14base在两个外显子上的互补序列作为引物，分别扩增两个外显子序列，然后再做重叠PCR，或者参考缺失突变的做法，实际也差不多。