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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
27楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 10:57:38
您好！谢谢您的耐心和热心帮助！我对第一个解决路线不是很理解，是反转录后，用特异性上游引物和Oligo（dT）引物来做PCR扩增，然后，将此RT-PCR产物克隆至克隆载体，测序初步表明是目的产物后再同时用特异性上游引 ...

“因为反转录的时候，已经有同时用到Oligo（dT）和Ramdom 6 mers引物了，理论上Oligo（dT）引物可以将mRNA调取出来，即反转录液里就算有DNA的污染，应该也会有cDNA存在而扩到不含内含子的CDS的，可是我的PCR产物里，只有含内含子的目的基因，在相应的位置上，不含内含子的CDS产物连个影都没有，我不是很理解。”
我大致理解了你的话：你是说有内含子的DNA有编码区，没有内含子的DNA也同时没有编码区。
如果是这样，可能有3个原因：
1.你的mRNA转录的随机性太大，也就是因为要转录的DNA片段较长，随机引物6聚体的结合位点太多，导致转录本随机性过多。
2.模板DNA存在污染。
3.Oligo（dT）引物引物太短，导致专业性不够。
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31楼2013-06-23 12:12:04
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
4.随机引物的专一性不够，可以换成基因特异性引物。随机引物法的专一性较低，引物在整个转录本中的多个位点退火，产生短的和部分长度的cDNA。基因特异性引物起始比随机引物特异性高很多，Oligo（dT）引物其实介于两者之间。
5.可能需要提高RT-PCR的专一性：分离出高质量的mRNA；提高逆转录酶的保温问题；添加促进逆转录的添加剂:包括低于10%的甘油或者低于10%的DMSO；RT-PCR过程中加入RNase；设计高质量的PCR引物。
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32楼2013-06-23 12:27:35
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
回答27楼：
第六个原因：
6.mRNA是不是已经断裂或者降解了。

31楼到33楼都是回答楼主的27楼的问题。我是逐步想起来的各种可能的原因，所以分成几贴回答。
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33楼2013-06-23 12:32:57
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
27楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 10:57:38
您好！谢谢您的耐心和热心帮助！我对第一个解决路线不是很理解，是反转录后，用特异性上游引物和Oligo（dT）引物来做PCR扩增，然后，将此RT-PCR产物克隆至克隆载体，测序初步表明是目的产物后再同时用特异性上游引 ...

“因为反转录的时候，已经有同时用到Oligo（dT）和Ramdom 6 mers引物了，理论上Oligo（dT）引物可以将mRNA调取出来，即反转录液里就算有DNA的污染，应该也会有cDNA存在而扩到不含内含子的CDS的，可是我的PCR产物里，只有含内含子的目的基因，在相应的位置上，不含内含子的CDS产物连个影都没有，我不是很理解。”

在PCR产物里，只有含内含子的目的基因，在相应的位置上，不含内含子的CDS产物连个影都没有。归纳上面六条原因，具体为什么会有内含子与编码区偶联的情况，可能是因为在genomic DNA上的完全目的基因序列的5’和3’末端区可能有一些与6碱基随机引物且很比较紧密的6碱基区，可能是含有较高的GC，在genomic DNA上的完全目的基因序列的对应的mRNA的5’和3’末端区（5’-UTR和3’-UTR)可能不仅是有一些与6碱基随机引物且很比较紧密的6碱基区，可能是含有较高的GC，而且在这些6碱基区的相邻区域可能存在某些二级结构而影响了随机碱基6聚体引物在另外一些区域的随机结合，或者促进了5’-UTR和3’-UTR的结合随机引物的效率。并且这种概率在PCR中得到了进一步的放大。
另外也可能是在genomic DNA上的完全目的基因序列的对应的mRNA的5’和3’末端区（5’-UTR和3’-UTR)的二级结构和特异性的序列成为机械剪切力和RNase的作用位点的几率较高。并且这种概率在PCR中得到了进一步的放大。
所以引起genomic DNA上的完全目的基因序列的内含子与编码区偶全留或者全丢的概率比较大，并且在PCR中得到了至少第二次的进一步的放大。
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lmcyjxs
34楼2013-06-23 13:59:56
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
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28楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-23 11:46:00
你的实验流程我没有完全看懂。可能是因为我做PT-PCR较少，比如我不懂你的RT-PCR流程中为什么要水解DNA？

我先就你的你的这贴讨论。在RT-PCR时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo(T)-Adaptor Prime ...

谢谢您的热心解答！
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思路决定出路。。。
35楼2013-06-23 14:17:22
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-23 11:46:00
你的实验流程我没有完全看懂。可能是因为我做PT-PCR较少，比如我不懂你的RT-PCR流程中为什么要水解DNA？

我先就你的你的这贴讨论。在RT-PCR时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo(T)-Adaptor Prime ...

您好！看了您这么多回复，心存感激！谢谢！
    RT-PCR时，将RNA反转录成cDNA 的引物可以使用Random 6 mers、Oligo dT Primer 或特异性下游引物。3种引物适用范围不同，特别是考虑到有些真核生物的mRNA不具有Poly（A）尾的问题，为使反转录完全，我RT时，将Random 6 mers、Oligo dT Primer同时使用了。
     然后用特异性引物和上述反转录液扩增，得到的PCR产物，电泳结果与下图的目的片段1相同，对PCR产物T-A克隆，测序结果比对表明，自己扩了的是基因组序列。将内含子去掉之后，与引物设计的原模板（完整CDS区）比对，相似度很高。足以再次说明，自己扩的是含有内含子的基因组序列。
大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了
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36楼2013-06-23 14:26:53
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
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29楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-23 11:54:45
“ 因为反转录的时候，已经有同时用到Oligo（dT）和Ramdom 6 mers引物了，理论上Oligo（dT）引物可以将mRNA调取出来，即反转录液里就算有DNA的污染，应该也会有cDNA存在而扩到不含内含子的CDS的，可是我的PCR产物里 ...

您分析的：“因为你的转录本是没有在细胞内经过了转录后加工的，也就是说完全有可能存在内含子序列。所以在反转录时要用没有内含子序列的DNA。”因此我提取RNA，然后反转录后，再用自己的特异性引物来扩增。
就因为我这么做了，但纠结于为什么自己采用cDNA为模板，扩出来的会是含内含子的基因组序列，无法继续做下面的蛋白表达实验。理论上，我采用了cDNA为模板，不该含内含子，扩出来的应该是CDS全长，电泳结果应该如目的片段2。
大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了-1
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37楼2013-06-23 14:28:28
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
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34楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-23 13:59:56
“因为反转录的时候，已经有同时用到Oligo（dT）和Ramdom 6 mers引物了，理论上Oligo（dT）引物可以将mRNA调取出来，即反转录液里就算有DNA的污染，应该也会有cDNA存在而扩到不含内含子的CDS的，可是我的PCR产物里 ...

之前看到前面几帖，我想到这样：
1 随机引物6聚体的结合位点太多，导致转录本随机性过多
解决方法：反转录时，只加Oligo dT随机引物，降低反转录的随机性
2 模板DNA存在污染
解决方法：用DNAse I消化总RNA中的DNA或设计跨内含子的引物
3 Oligo（dT）引物太短，导致专业性不够及随机引物的专一性不够
解决方法：直接在反转录时就加自己的特异性引物。
4 “mRNA是不是已经断裂或者降解了”
mRNA极易降解，但因为自己已扩增得到该目的酶基因的基因组序列了，所以对于您分析的这点“mRNA是不是已经断裂或者降解了”，我觉得应该不是主要原因。
5 提取高质量RNA
     现在，看到这一帖，我觉得对我很有帮助，极有可能跟您说的一样“genomic DNA上的完全目的基因序列的5’和3’末端区可能有一些与6碱基随机引物且很比较紧密的6碱基区”，或许这会是我问题的根源之一。因为，测序结果表明，在5‘端还存在好像约有100bp的非编码区，我会去尝试一下这一点，即不用随机碱基6聚体引物来做反转录，直接用Oligo dT或特异性引物来做，看看结果。
    您很用心，很有耐心，也很善分析，值得我学习！谢谢！
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38楼2013-06-23 14:36:29
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凌波丽

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37楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 14:28:28
您分析的：“因为你的转录本是没有在细胞内经过了转录后加工的，也就是说完全有可能存在内含子序列。所以在反转录时要用没有内含子序列的DNA。”因此我提取RNA，然后反转录后，再用自己的特异性引物来扩增。
就因 ...

我的建议是用基因特异性引引物启动RT-PCR；另外注意模板避免污染，如果使用了不含内含子的模板仍有内含子序列出现，那只能说明模板不纯，被污染了，建议提纯模板。
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39楼2013-06-23 15:38:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
38楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 14:36:29
之前看到前面几帖，我想到这样：
1 随机引物6聚体的结合位点太多，导致转录本随机性过多
解决方法：反转录时，只加Oligo dT随机引物，降低反转录的随机性
2 模板DNA存在污染
解决方法：用DNAse I消化总RNA中的 ...

做RT-PCR时，反转录所用的mRNA模板应该分离提纯。只用DNAse I消化总RNA中的DNA或设计跨内含子的引物不可能完全去除长链的DNA。

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA，proctocol举例如下：
一、试剂准备
1．3M醋酸钠（pH 5.2）
2．0.1M NaOH
3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。
4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．无水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
二、操作步骤
1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。
5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。
7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。
8．OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。
9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。
10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事项1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。

此proctocols仅为举例，不是唯一的试验流程，你可以查一下相关的实验手册。
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40楼2013-06-23 16:38:22
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