大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了 - 分子生物 - 综合其他

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lmcyjxs

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40楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-23 16:38:22
做RT-PCR时，反转录所用的mRNA模板应该分离提纯。只用DNAse I消化总RNA中的DNA或设计跨内含子的引物不可能完全去除长链的DNA。

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。 ...

嗯，谢谢

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思路决定出路。。。

41楼2013-06-23 22:36:30

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547star

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不知道实验目的是什么。如果是克隆基因，直接拿基因组DNA分别PCR两个外显子区再做重叠PCR（要求扩增外显子的中间那2条引物有比较长的重叠区）。
上游用特异性引物，下游用Oligo(dT)来做RT-PCR，既保证特异性，也保证是从mRNA扩增的；双特异性引物和随机引物，都有可能从基因组DNA扩增。另外mRNA丰度不高或提取质量不高，目的mRNA很少，甚至没有，用的又是特异性引物和随机引物，就可能扩增到基因组DNA，解决的办法是选择目的蛋白表达含量高/意味着目的基因mRNA相对比较多的组织来提取，提取过程也要注意避免mRNA降解。发这么多帖子，就没一个RNA提取的图，也没说明实验意图，也不说明从哪里提取，那是想先弄明白问题再做课题了，那就继续吧；如果只是表达，不一定要做RT-PCR，特别是实验室条件不适合做RNA，做RT-PCR时，直接用高保真酶先分段扩增再做重叠PCR就好了，特别是只有2个片段。
纠结于前面的这些问题，往往会耽误实验的，暂时放下，以后有机会等去到条件好的实验室，也会做出漂亮的实验结果来，不是所有的意外失败会通向新的科学领域，该坚持的时候坚持，该换路线的时候就转过来。

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为什么

42楼2013-06-26 16:22:47

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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

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42楼: Originally posted by 547star at 2013-06-26 16:22:47
不知道实验目的是什么。如果是克隆基因，直接拿基因组DNA分别PCR两个外显子区再做重叠PCR（要求扩增外显子的中间那2条引物有比较长的重叠区）。
上游用特异性引物，下游用Oligo(dT)来做RT-PCR，既保证特异性，也保 ...

说的很有道理！很受用！
我是想做基因克隆的，因为经验不足吧，当时没想到用基因组DNA分别PCR两个外显子区再做重叠PCR的方法来做。本想克隆到一个关键酶基因后就做表达的，只是分析到后面，才发现不对劲，才知道自己扩的是基因组DNA。
实验条件确实不太好，从植物心材里提取的RNA质量没有很好，OD比值在1.75时也用了。
现在是打算换思路来做了，但也还是想把之前的做出来，想知道问题的症结到底在哪。
谢谢~

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思路决定出路。。。

43楼2013-06-26 18:25:27

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