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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
40楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-23 16:38:22
做RT-PCR时,反转录所用的mRNA模板应该分离提纯。只用DNAse I消化总RNA中的DNA或设计跨内含子的引物不可能完全去除长链的DNA。

mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。 ...

嗯,谢谢
思路决定出路。。。
41楼2013-06-23 22:36:30
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547star

木虫 (著名写手)

不知道实验目的是什么。如果是克隆基因,直接拿基因组DNA分别PCR两个外显子区再做重叠PCR(要求扩增外显子的中间那2条引物有比较长的重叠区)。
上游用特异性引物,下游用Oligo(dT)来做RT-PCR,既保证特异性,也保证是从mRNA扩增的;双特异性引物和随机引物,都有可能从基因组DNA扩增。另外mRNA丰度不高或提取质量不高,目的mRNA很少,甚至没有,用的又是特异性引物和随机引物,就可能扩增到基因组DNA,解决的办法是选择目的蛋白表达含量高/意味着目的基因mRNA相对比较多的组织来提取,提取过程也要注意避免mRNA降解。发这么多帖子,就没一个RNA提取的图,也没说明实验意图,也不说明从哪里提取,那是想先弄明白问题再做课题了,那就继续吧;如果只是表达,不一定要做RT-PCR,特别是实验室条件不适合做RNA,做RT-PCR时,直接用高保真酶先分段扩增再做重叠PCR就好了,特别是只有2个片段。
纠结于前面的这些问题,往往会耽误实验的,暂时放下,以后有机会等去到条件好的实验室,也会做出漂亮的实验结果来,不是所有的意外失败会通向新的科学领域,该坚持的时候坚持,该换路线的时候就转过来。
为什么
42楼2013-06-26 16:22:47
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
42楼: Originally posted by 547star at 2013-06-26 16:22:47
不知道实验目的是什么。如果是克隆基因,直接拿基因组DNA分别PCR两个外显子区再做重叠PCR(要求扩增外显子的中间那2条引物有比较长的重叠区)。
上游用特异性引物,下游用Oligo(dT)来做RT-PCR,既保证特异性,也保 ...

说的很有道理!很受用!
我是想做基因克隆的,因为经验不足吧,当时没想到用基因组DNA分别PCR两个外显子区再做重叠PCR的方法来做。本想克隆到一个关键酶基因后就做表达的,只是分析到后面,才发现不对劲,才知道自己扩的是基因组DNA。
实验条件确实不太好,从植物心材里提取的RNA质量没有很好,OD比值在1.75时也用了。
现在是打算换思路来做了,但也还是想把之前的做出来,想知道问题的症结到底在哪。
谢谢~
思路决定出路。。。
43楼2013-06-26 18:25:27
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biology-girl

新虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 137167741 at 2013-06-14 20:52:29
第一、基础知识的确需要补一下,小小批评一下
第二、所谓cds区,就是指编码区,什么叫编码区,就是编码蛋白的区域,而你在ncbi查找到的这个序列式DNA序列,如果你的截图没有错误的话,应该是ncbi的标题有问题 ...

汉子
44楼2014-07-19 09:14:29
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biology-girl

新虫 (正式写手)

引用回帖:
40楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-06-23 16:38:22
做RT-PCR时,反转录所用的mRNA模板应该分离提纯。只用DNAse I消化总RNA中的DNA或设计跨内含子的引物不可能完全去除长链的DNA。

mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。 ...

纸上谈兵
45楼2014-07-19 10:30:03
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