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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

[求助] 大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子?看了相关的帖反而把我搞糊涂了

各位大侠,我要崩溃了,不是说我没之前没看过帖,而是看了帖之后把我搞混了。
      1 CDS区到时含不含内含子?有一个老师说不含,一个说含,我看了论坛,两种说法我都好像看过。我认为是不含的。
      2 如果CDS区不含内含子,有些基因在NCBI里查到的,标题上注明是全长CDS区,但下面的注释里却显示含有很多个CDS区,基因序列也显示含有多个CDS区,如图1,难道CDS区真含有内含子才是正解?但为什么我克隆了一个基因,反转录得到的,不含内含子了,获得的基因就跟图1情况一样,终止密码子还更多,导致多个CDS区存在,怎么会这样呢?如图2
      3 若在一个基因序列里,含有多个CDS区(就是在多个不同位置含终止密码子),连接到表达载体是不是指翻译其识别的第一个CDS?
大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子?看了相关的帖反而把我搞糊涂了
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大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子?看了相关的帖反而把我搞糊涂了-1
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思路决定出路。。。
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

引用回帖:
38楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 14:36:29
之前看到前面几帖,我想到这样:
1 随机引物6聚体的结合位点太多,导致转录本随机性过多
解决方法:反转录时,只加Oligo dT随机引物,降低反转录的随机性
2 模板DNA存在污染
解决方法:用DNAse I消化总RNA中的 ...

做RT-PCR时,反转录所用的mRNA模板应该分离提纯。只用DNAse I消化总RNA中的DNA或设计跨内含子的引物不可能完全去除长链的DNA。

mRNA的分离方法较多,其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A+)的特点,在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被洗脱,经过两次寡聚(dT)纤维柱后,即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA,proctocol举例如下:
一、试剂准备
1.3M醋酸钠(pH 5.2)
2.0.1M NaOH
3.1×上样缓冲液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SLS至终浓度为0.1%。
4.洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS
5.无水乙醇、70%乙醇
6.DEPC
二、操作步骤
1.将0.5-1.0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2.用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管,将寡聚(dT)-纤维素装柱0.5-1ml,用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3.使用1×上样缓冲液洗柱,直至洗出液pH值小于8.0。
4.将RNA溶解于DEPC H2O中,在65℃中温育10min左右,冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液,混匀后上柱,立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后,再用1×上样缓冲液洗柱,继续收集流出液。
5.将所有流出液于65℃加热5min,冷却至室温后再次上柱,收集流出液。6.用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱,每管1ml分部收集,OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高,其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。
7.用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA,分部收集,每部分为1/3-1/2柱体积。
8.OD260测定Poly(A+)RNA分布,合并含Poly(A+)RNA的收集管,加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20℃放置30min。
9.4℃离心,10000g×15min,小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意:此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心,10000g×5min,弃上清,室温晾干。
10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事项1.整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2.步骤(4)中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构,使Poly(A+)尾充分暴露,从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合,否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3.十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4.寡聚(dT)-纤维素柱可在4℃贮存,反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。5.一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%。

此proctocols仅为举例,不是唯一的试验流程,你可以查一下相关的实验手册。
40楼2013-06-23 16:38:22
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laoshi0633

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
lmcyjxs: 金币+1, 有帮助, 谢谢! 2013-06-14 17:10:09
您难道不知道特殊位置的TGA可以编码硒代半胱氨酸,Selenocysteine,
国内外很多人在研究这一课题
学习是一种信仰
2楼2013-06-14 16:27:25
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laoshi0633

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


lmcyjxs: 金币+1, 有帮助, 期待这位大牛继续多多指点,新手表示好好学习,天天向上~ 2013-06-14 17:11:26
1,你的认为是错误的。
2,基础知识有待积累
3,答案是可定的终止,除非你做特殊处理
学习是一种信仰
3楼2013-06-14 16:31:36
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by laoshi0633 at 2013-06-14 16:27:25
您难道不知道特殊位置的TGA可以编码硒代半胱氨酸,Selenocysteine,
国内外很多人在研究这一课题

弱弱地惭愧地表示真不知道~会好好补充这一知识,谢谢。
思路决定出路。。。
4楼2013-06-14 17:07:52
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