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lmcyjxs

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[求助] 大牛来指点下啊~CDS区到底含不含内含子？看了相关的帖反而把我搞糊涂了

各位大侠，我要崩溃了，不是说我没之前没看过帖，而是看了帖之后把我搞混了。
   1 CDS区到时含不含内含子？有一个老师说不含，一个说含，我看了论坛，两种说法我都好像看过。我认为是不含的。
   2 如果CDS区不含内含子，有些基因在NCBI里查到的，标题上注明是全长CDS区，但下面的注释里却显示含有很多个CDS区，基因序列也显示含有多个CDS区，如图1，难道CDS区真含有内含子才是正解？但为什么我克隆了一个基因，反转录得到的，不含内含子了，获得的基因就跟图1情况一样，终止密码子还更多，导致多个CDS区存在，怎么会这样呢？如图2
   3 若在一个基因序列里，含有多个CDS区（就是在多个不同位置含终止密码子），连接到表达载体是不是指翻译其识别的第一个CDS？

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思路决定出路。。。

1楼 2013-06-14 16:15:35

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凌波丽

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引用回帖:

38楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-06-23 14:36:29
之前看到前面几帖，我想到这样：
1 随机引物6聚体的结合位点太多，导致转录本随机性过多
解决方法：反转录时，只加Oligo dT随机引物，降低反转录的随机性
2 模板DNA存在污染
解决方法：用DNAse I消化总RNA中的 ...

做RT-PCR时，反转录所用的mRNA模板应该分离提纯。只用DNAse I消化总RNA中的DNA或设计跨内含子的引物不可能完全去除长链的DNA。

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA，proctocol举例如下：
一、试剂准备
1．3M醋酸钠（pH 5.2）
2．0.1M NaOH
3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。
4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS
5．无水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
二、操作步骤
1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。
5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。
7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。
8．OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。
9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。
10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事项1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。

此proctocols仅为举例，不是唯一的试验流程，你可以查一下相关的实验手册。