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luocongqiang铁虫 (小有名气)
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western blot
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| western blot 可以检测原核生物蛋白吗 |
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myprayer
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【答案】应助回帖
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做wb你首先要清楚它的作用是什么，最基本的要搞懂在下手做实验。 以下是wb的详细信息供你参考，以后发帖尽可能发比较高级的帖子小虫子给的金币也不少哇。免疫印迹技术又称蛋白质印迹(Western blotting)是一种借助抗原鉴定特异性抗体的有效方法，该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。本实验以检测可提取性核抗原(ENA)抗体为例。 【实验原理】 先将ENA混合抗原经SDS-PAGE电泳，使各种抗原成分根据分子量不同区分开来，再通过电转印将各种抗原成分转印到硝酸纤维素薄膜上，血清中抗ENA抗体与硝酸纤维素薄膜上的ENA抗原成分结合，再与碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体结合，形成抗原抗体酶标抗体复合物，洗涤后加入底物显色，根据有无显色带的出现判断抗ENA抗体的有无，显色带的位置判断抗ENA抗体的类型。 【主要试剂与器材】 1.ENA多肽抗体谱检测试剂盒 包括印有ENA的硝酸纤维素薄膜、碱性磷酸酶记标的抗人IgG抗体、显色液(BCIP/NBT)、浓缩洗涤液和样品缓冲液、终止液、ENA多肽抗体标准带图谱等，有商品供应。 2.待检血清和阳性质控血清 3.小型摇床、恒温箱、反应槽、吸管、微量移液器、滤纸等。 【操作方法】 1.将浓缩洗涤液、样品稀释液按说明书用蒸馏水进行稀释。 2.抗原条放入反应槽中，每个槽内加入样品稀释液1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体。 3.用样品稀释液将血清1∶10稀释，吸取1.5ml稀释血清加入槽内，置小型摇床上孵育30min。 4.弃去槽内液体，每个槽内加入1∶10稀释的洗涤液 1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体，用吸水纸吸干。 5.吸取1.5ml用样品稀释液1∶10稀释AP标记的抗人 IgG，加入槽内，置小型摇床上孵育30min。 6. 同4洗涤。 7.每个槽内加入底物液1.5ml，置小型摇床上孵育 20min后，弃去槽内液体，用自来水洗净，加入终止液。 8.与标准显色带比较，判断结果。 【结果判断】 将印迹膜上出现的显色区带与标准图谱比较，可判断哪种ENA抗体阳性。 【注意事项】 1.洗涤液需在37℃预热，且实验过程都用预热洗涤液。 2.显色时，必需使用小型摇床摇动反应槽，使染色均匀。显色时间可根据质控血清显色清晰为准。 3.不同批号的标准带图谱不可混用。 【应用与评价】 1.免疫转印技术具有电泳技术分辨力强及免疫反应特异性强和免疫标记技术灵敏度高的特点，可检出最小蛋白量达1pg；不需要纯化抗原，可在同一印迹条上作多种抗体检测；用酶标抗体法进行显色，结果比较清晰，便于观察；结果便于保存，印迹膜可存放6～12月；由于SDS-PAGE和电转移步骤复杂、技术性强、影响因素多、不容易掌握，不太适合临床实验室常规开展，但是使用商品化的印迹膜使检测方法变得非常简单，一般基层医院都能开展。 2.核内可提取性抗原ENA是核物质中一类蛋白的总称。因这类核蛋白的共同特点是不含有组蛋白，且均能浴于生理盐水和磷酸盐缓冲液，故被称为核内可提取性抗原。其大多数属于酸性蛋白，对RNA酶敏感，56℃10min即可使其灭活。针对这些抗原产生的抗体，被称为抗ENA抗体。其各自的临床意义有所不同，以下列举常见的几种： 抗Sm：SLE的标记性抗体 抗U1RNP：混合性结缔组织病(MCTD)中阳性率极高，达 95%以上。 抗SSA：在SLE等风湿病中均可出现，常与抗SSB同时出现，提示干燥综合症的可能。 抗SSB：常与抗SSA同时出现，提示干燥综合症的可能。 抗Scl-70：阳性提示多发性硬化症的可能。 抗Jo-1：阳性提示多发性肌炎、皮肌炎的可能。 抗rRNP：SLE患者神经受累的标记性抗体 |
3楼2013-05-30 18:49:16
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