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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于原核表达结果的分析及原因
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[求助] 关于原核表达结果的分析及原因

做了4个基因的原核表达  蛋白表达图
图中1,2 为空载体pET28a(+)，3,4 为一个基因，5,6为第二个基因，7,8为第三个基因，9,10为第四个基因
     1,3,5,7,9为未诱导的蛋白表达情况条带，2,4,6,8,10为用IPTG诱导5h后的蛋白表达情况条带
     1,2诱导前后没有变化；泳道4为诱导后的第一个基因，较泳道3有明显变化，且大小与预测的蛋白大小一致；泳道6为诱导后的第二个基因，较泳道5也有差异，且大小与预测的蛋白大小一致；
      但泳道8为诱导后的第三个基因，较泳道7有两处明显差异，其中一个为与预测大小一致的，但另外一个不知道是什么原因造成的。泳道10为诱导后的第四个基因，较泳道9有三处明显差异，其中一个为与预测大小一致的，另外两个不知道是什么，请大家帮忙分析一下。
麻烦大家帮忙分析一下原因，谢谢！

FVO@@SHH4_87IPYW0KL{IM9.jpg
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1楼2013-05-15 20:01:48
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
赞一下楼主的详细描述!
分子量较小的, 多出的蛋白可能是一部分大量表达出的目标蛋白降解造成的. 其实这个阶段楼主不必太在意这些多出的条带, 因为你接下来应该会做蛋白纯化吧? 纯化完了再跑个胶说不定多余的条带就消失了.
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2楼2013-05-15 20:29:53
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你做一个WESTERN Blotting,就可以说明结果了！
用可以显色6个His标签的抗体，如果western blotting的结果显示8泳道和10泳道的蛋白条带>=2条，说明你的蛋白降解了！这只能说明你的蛋白稳定性较差！

如果western结果显示只有一条带！！！那你管他几条带，方正我还要过NI柱纯化，只有我的目的蛋白能挂上，其他的又挂不上！他可能是宿主菌的非特异性条带！第10泳道最上面最粗的那条带可能就是非特异性条带，你的诱导条件可能满足了他的表达，所以表达量就大了！！你可以参照前面泳道，都有这条带的！！


希望能给你点帮助！！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
3楼2013-05-15 20:43:38
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niushuaiji

金虫 (正式写手)

不放弃的小鸟

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
western blot，是不是目的片段降解产物就可以看出了，应该都会有非目的诱导条带的出现
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Tobeornottobe,that'saproblem
4楼2013-05-16 10:34:04
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by niushuaiji at 2013-05-16 10:34:04
western blot，是不是目的片段降解产物就可以看出了，应该都会有非目的诱导条带的出现

我没有再做western blot  就做到原核表达这里就停止了   所以现在想知道出现非特异性目的条带的原因
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5楼2013-05-16 10:54:02
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 不转录的DNA at 2013-05-15 20:43:38
你做一个WESTERN Blotting,就可以说明结果了！
用可以显色6个His标签的抗体，如果western blotting的结果显示8泳道和10泳道的蛋白条带>=2条，说明你的蛋白降解了！这只能说明你的蛋白稳定性较差！

如果weste ...

我的试验就到这里就结束了  因为没有人指导 所以自己折腾到这里就停下了  算是硕士试验结束   现在就是想知道多出来的原因   好在答辩时不被挂在台上下不来
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6楼2013-05-16 11:17:50
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-15 20:29:53
赞一下楼主的详细描述!
分子量较小的, 多出的蛋白可能是一部分大量表达出的目标蛋白降解造成的. 其实这个阶段楼主不必太在意这些多出的条带, 因为你接下来应该会做蛋白纯化吧? 纯化完了再跑个胶说不定多余的条带就 ...

试验到这里就结束了  
所以疑问比较多
谢谢
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7楼2013-05-16 11:19:18
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2013-05-16 11:17:50
我的试验就到这里就结束了  因为没有人指导 所以自己折腾到这里就停下了  算是硕士试验结束   现在就是想知道多出来的原因   好在答辩时不被挂在台上下不来...

楼主！我问你：假如你答辩的时候，教授问你：那几条带是什么？

你说：是非特异性条带！

教授：你怎么知道他是非特异性条带？做过验证吗？

你说：没有，是在小木虫上大家都这么说的！

教授：我还说这是你蛋白降解了呢！！！

请问你怎么回答！！！！！！！！！你可能还是被挂在台子上！！！！

做学术，要懂得严谨性！！不能确定的问题！你就需要验证！学术界没有验证，你就没有发言权！！！
我劝你还是做个western blotting!

良言！！希望能采纳······
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
8楼2013-05-16 11:29:11
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26264716

铁虫 (小有名气)
做个原核诱导就完了。。。。硕士就毕业了。。。我了个去啊。。太幸福了嘛。。
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苦，才是人生
9楼2013-05-16 12:24:39
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不转录的DNA

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可能我说的话有点过了！希望你能谅解！
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长得比我英俊的，没我有才华！有才华的，没我长得俊！
10楼2013-05-16 18:16:38
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