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cherryall

新虫 (初入文坛)

[交流] Western Blot 实验问题 已有2人参与

各位高手,小弟有一关于Western的实验问题想请教一下。
最近我一直在做Western,但是遇到了一个很奇怪的问题。我用GFP标签抗体检测的膜上有明显的目的条带,大小也符合。但是我用自己的特异性抗体检测的时候,有几条带,但是却一直没有我的目的蛋白带,大小总是会偏大一些。我已经重复好几回了,都是同样的结果。
所以我想请教一下大侠们,这是什么原因呢?求赐教!
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cherryall

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-09 22:01:49
不管是一条带还是几条带, 只要分子量不要差得太离谱都有可能是真的.
你的问题是信号分子量不能重合. 既然你要检测的蛋白是和GFP融合的, 下次实验的时候你带上一个野生型对照吧, 这样你就知道是那个抗体出问题了.

用发光Marker比对过后,可以明显看出特异性抗体处理的条带比GFP抗体处理的条带要大10KD左右。而且我已经多次变换了不同的条件来转膜后处理,但每次结果还是一样的。
4楼2013-05-15 21:18:18
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-05-10 08:35:23
不管是一条带还是几条带, 只要分子量不要差得太离谱都有可能是真的.
你的问题是信号分子量不能重合. 既然你要检测的蛋白是和GFP融合的, 下次实验的时候你带上一个野生型对照吧, 这样你就知道是那个抗体出问题了.
2楼2013-05-09 22:01:49
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谦卑的猴子

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
分子量可能会有偏差,不过不能离得太远
一定要争气
3楼2013-05-10 14:56:16
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bullfrog325

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by cherryall at 2013-05-15 21:18:18
用发光Marker比对过后,可以明显看出特异性抗体处理的条带比GFP抗体处理的条带要大10KD左右。而且我已经多次变换了不同的条件来转膜后处理,但每次结果还是一样的。...

没有表达融合蛋白的样品WB的结果是什么样子呢, 分别用特异抗体和GFP抗体做一抗的时候?
5楼2013-05-15 23:29:11
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