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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Western Blot 实验问题
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cherryall

新虫 (初入文坛)

[交流] Western Blot 实验问题 已有2人参与

各位高手，小弟有一关于Western的实验问题想请教一下。
最近我一直在做Western，但是遇到了一个很奇怪的问题。我用GFP标签抗体检测的膜上有明显的目的条带，大小也符合。但是我用自己的特异性抗体检测的时候，有几条带，但是却一直没有我的目的蛋白带，大小总是会偏大一些。我已经重复好几回了，都是同样的结果。
所以我想请教一下大侠们，这是什么原因呢？求赐教！
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1楼 2013-05-09 21:42:37
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-05-10 08:35:23
不管是一条带还是几条带, 只要分子量不要差得太离谱都有可能是真的.
你的问题是信号分子量不能重合. 既然你要检测的蛋白是和GFP融合的, 下次实验的时候你带上一个野生型对照吧, 这样你就知道是那个抗体出问题了.
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2楼2013-05-09 22:01:49
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谦卑的猴子

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
分子量可能会有偏差，不过不能离得太远
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一定要争气
3楼2013-05-10 14:56:16
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cherryall

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-09 22:01:49
不管是一条带还是几条带, 只要分子量不要差得太离谱都有可能是真的.
你的问题是信号分子量不能重合. 既然你要检测的蛋白是和GFP融合的, 下次实验的时候你带上一个野生型对照吧, 这样你就知道是那个抗体出问题了.

用发光Marker比对过后，可以明显看出特异性抗体处理的条带比GFP抗体处理的条带要大10KD左右。而且我已经多次变换了不同的条件来转膜后处理，但每次结果还是一样的。
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4楼2013-05-15 21:18:18
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by cherryall at 2013-05-15 21:18:18
用发光Marker比对过后，可以明显看出特异性抗体处理的条带比GFP抗体处理的条带要大10KD左右。而且我已经多次变换了不同的条件来转膜后处理，但每次结果还是一样的。...

没有表达融合蛋白的样品WB的结果是什么样子呢, 分别用特异抗体和GFP抗体做一抗的时候?
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5楼2013-05-15 23:29:11
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