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374695805

新虫 (初入文坛)

[求助] DNA洗涤沉淀

（一）DNA和载体经T4 Ligase连接以后要进行电转化，所以连接体系要纯化，步骤如下：
(1)加入2.5 μl（1/10量）的3 M CH3COONa（pH5.2）。
(2)加入62.5 μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
(3)离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
(4)25～50 μl TE溶解，10～20 μl转化至100 μl的感受态细胞中。
之前做了几次连接和电转化，都没有成功，阳性对照转化了，阴性对照没转化，连接产物也没转化，估计洗涤沉淀过程中把连接产物连同上层溶液一起倒掉去除。（电转化过程中的放电时间一般介于4~5ms左右，但是连接产物的放电时间跟上述时间有较大差异，相差2个数量级）。
请问，第(3)步中，离心回收沉淀，由于DNA用肉眼根本看不到，怎样保证弃去上层溶液的时候不会把管底的DNA沉淀一起倒掉啊？求具体的操作要点！
（二）分布双酶切的具体步骤是什么？切完一个之后用什么方法纯化？纯化试剂盒还是和上述（一）所提到的洗涤沉淀？
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1楼 2013-05-08 22:28:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
374695805(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-05-09 08:16:40
直接拿2μl连接产物电转化40μl感受态，不用做纯化。纯化的目的是去掉体系里的盐，否则电转化时形成电弧。如果连接产物用量很少，小于体系的5%，就可以直接用。
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2楼2013-05-09 02:22:33
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